骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠外科肝損傷的修復(fù)與體內(nèi)示蹤的研究.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計(jì),肝臟損傷約占腹部外傷的15％～20%,嚴(yán)重威脅著人類的健康甚至生命。隨著交通運(yùn)輸業(yè)的飛速發(fā)展及車輛的頻繁增加導(dǎo)致的肝臟外傷和肝臟原有的基礎(chǔ)疾病等導(dǎo)致肝臟部分切除或大部切除的發(fā)生率在日益升高,因此,大鼠外科肝損傷模型的建立對(duì)臨床和科學(xué)研究的作用也顯得越來越突出。經(jīng)典的部分肝切除模型是1931年Higgins和Anderson首先報(bào)道的,這項(xiàng)研究將大鼠肝臟的中葉和左葉切除,約占總體積的70%,由于手術(shù)方法的簡便快捷而被廣泛學(xué)習(xí)采用。

2、之后雖有很多學(xué)者報(bào)道對(duì)大鼠做部分肝切除手術(shù),但由于出于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?尚未對(duì)手術(shù)組和正常對(duì)照組大鼠的生存狀態(tài)、肝功能情況及肝臟病理作系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。除此之外,也尚未見系統(tǒng)建立大鼠外科肝損傷模型的報(bào)道。
　　 原位肝移植(Orthotopic liver transplantation,OLT)是目前治療各種終末期肝臟疾病的有效方法,但隨著這種治療方法弊端的日益暴露,如肝臟供體短缺、免疫排斥、移植物抗宿主病等,使得OLT在臨床上

3、的研究進(jìn)展受到了限制。隨著干細(xì)胞研究和應(yīng)用領(lǐng)域的深入,細(xì)胞移植治療肝臟損傷已成為人們的研究熱點(diǎn)。大量文獻(xiàn)報(bào)道表明,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外特定條件和微環(huán)境下可以轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞,并呈現(xiàn)肝細(xì)胞的功能,而且移植的細(xì)胞優(yōu)先定居于受損傷的器官,這為細(xì)胞移植治療外科肝損傷提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。文獻(xiàn)報(bào)道,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)不同途徑同種異體移植入機(jī)體受損傷的肝臟,并且其對(duì)肝臟疾病具有很好的治療作用,但經(jīng)不同途徑移植入機(jī)體后,細(xì)胞在肝臟內(nèi)分布和定居效果的比較尚未見

4、文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 研究表明菲立磁可作為磁共振成像技術(shù)(MRI)示蹤骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的有效標(biāo)記物,且在一定的濃度下標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞后不會(huì)改變細(xì)胞和接受該細(xì)胞的器官的生物化學(xué)功能,因此菲立磁在實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療方面被作為標(biāo)記物而普遍采用。目前,利用菲立磁標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及MRI對(duì)其體外示蹤的方法經(jīng)門靜脈和體表淺靜脈對(duì)大鼠行細(xì)胞移植的報(bào)道較多,未見肝內(nèi)直接移植細(xì)胞及對(duì)其示蹤效果檢測的報(bào)道。以往細(xì)胞移植治療化學(xué)性肝損傷的報(bào)道較多,但尚

5、未見菲立磁標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療外科肝損傷及對(duì)其在外科肝損傷大鼠肝臟內(nèi)的分布和定居情況示蹤的報(bào)道。因此,我們首先建立大鼠外科肝損傷模型,擬利用菲立磁標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,通過不同途徑移植入大鼠肝臟內(nèi),用MRI對(duì)其進(jìn)行體外追蹤,以期建立最佳移植方案,利用此方案將菲立磁標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植入外科肝損傷模型的大鼠肝臟內(nèi),并用MRI對(duì)其進(jìn)行示蹤,進(jìn)一步探索骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)外科肝損傷大鼠肝功能的恢復(fù)效果及其在損傷肝臟內(nèi)的分布和定居情況。

6、　　 課題分以下三個(gè)部分
　　 一、大鼠外科肝損傷模型建立的研究
　　 目的:探討SD大鼠外科肝損傷動(dòng)物模型的制作方法。
　　 方法:選用8周齡SD大鼠40只,隨機(jī)分成模型組和對(duì)照組,每組20只。模型組切除大鼠肝臟總體積的70%;對(duì)照組在相同的條件下打開關(guān)閉腹腔;分別在術(shù)前和術(shù)后12h、1d、3d、5d、7d、14d對(duì)兩組大鼠頸靜脈采血,取血漿1 ml檢測兩組大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿

7、性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TB)和直接膽紅素(DBIL)指標(biāo),術(shù)后14 d大體和光鏡下觀察兩組大鼠肝臟的病理變化。
　　 結(jié)果:①模型組肝功能指標(biāo)AST、ALP和DBIL在術(shù)后12 h至7 d,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),ALT和TB在術(shù)后12 h至5 d與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),至術(shù)后14 d兩組大鼠肝功能各項(xiàng)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05):②術(shù)后14 d大體觀察大鼠肝臟:

8、對(duì)照組大鼠肝臟呈紅褐色,各葉很薄,分別以一小細(xì)蒂連接于肝門部,肝緣銳利。模型組大鼠殘余肝臟較對(duì)照組顏色加深,整個(gè)肝臟體積較前增大,表面有光澤,每個(gè)肝葉增厚,肥大,肝緣變鈍;鏡下觀察:對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞之間排列疏松,細(xì)胞棱角較銳利,肝竇較寬。模型組大鼠肝細(xì)胞棱角變鈍、肥大、水腫、嗜酸性變,細(xì)胞與細(xì)胞之間堆積緊密。
　　 結(jié)論:切除肝臟總體積70%的大鼠可以正常存活,且肝功能各項(xiàng)指標(biāo)和肝臟病理與對(duì)常組相比有顯著性差異,此方法可有效建立

9、大鼠外科肝損傷模型。
　　 二、不同途徑大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞同種異體肝臟移植效果的比較
　　 目的:比較經(jīng)不同移植途徑大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向同種異體大鼠肝臟移植的效果。
　　 方法:①大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的提取與檢測:選用5周齡SD大鼠,從大鼠股骨和脛骨的骨髓腔分離骨髓細(xì)胞,采用全骨髓細(xì)胞貼壁傳代培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,觀察各代細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞生長曲線;流式細(xì)胞技術(shù)檢測第3代細(xì)胞表面標(biāo)志;②大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的

10、標(biāo)記:用含菲立磁的全細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)第3代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞12 h,普魯士藍(lán)染色、顯微鏡下計(jì)數(shù)含藍(lán)色顆粒的細(xì)胞,估計(jì)標(biāo)記效率,電鏡掃描菲立磁的標(biāo)記情況。③分組移植:選用8周齡SD大鼠30只,隨機(jī)分成3組(肝內(nèi)移植組、門靜脈移植組、股靜脈移植組),每組10只,取濃度為1×106/ml菲立磁標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞1ml,分別經(jīng)大鼠肝實(shí)質(zhì)、門靜脈、股靜脈三種途徑移植到大鼠肝臟內(nèi),于移植后12 h、1d、3d、5d、7d、14d用MRI分別對(duì)三組

11、大鼠肝臟進(jìn)行掃描,并于移植后第14 d普魯士藍(lán)染色并在光鏡下觀察大鼠肝臟組織切片,對(duì)含藍(lán)色顆粒的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果:①大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的提取與檢測結(jié)果:骨髓來源的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞呈長梭型,類似成纖維細(xì)胞,胞體折光性好,流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD29(99.7%)和CD44(99.4%)呈陽性,造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34(1.3%)和自細(xì)胞共同抗原CD45(2.2%)呈陰性。②大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記結(jié)果:光鏡下菲

12、立磁標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞普魯士藍(lán)染色顯示細(xì)胞核和胞漿紅染,大部分細(xì)胞的胞漿中含有被染成藍(lán)色的鐵顆粒,細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算菲立磁的標(biāo)記效率可達(dá)90%以上。電鏡下的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞膜有很多突起的絨毛,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有散在的囊泡樣包涵體結(jié)構(gòu),內(nèi)含有高密度鐵顆粒,胞漿內(nèi)各種細(xì)胞器活性未見明顯異常。③分組移植結(jié)果:將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)不同途徑移植入大鼠肝臟內(nèi),肝內(nèi)移植組所有大鼠在移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MRI均能檢測到肝臟細(xì)胞移植部位橢圓形低信號(hào)區(qū),低信號(hào)范圍隨著

13、時(shí)間的延長逐漸縮小,信號(hào)強(qiáng)度逐漸升高;門靜脈移植組所有大鼠在移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MRI均能檢測到肝門區(qū)門靜脈內(nèi)分支狀低信號(hào)改變,信號(hào)強(qiáng)度低于肝內(nèi)移植組,隨著時(shí)間的延長低信號(hào)分布形態(tài)無明顯變化,信號(hào)強(qiáng)度逐漸升高;股靜脈移植組肝臟的各層面在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測到明顯低信號(hào)改變。移植后14 d三組大鼠肝臟組織切片均可見含藍(lán)色顆粒的細(xì)胞,肝內(nèi)移植組最多,門靜脈移植組次之,股靜脈移植組最少,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:對(duì)

14、菲立磁標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)肝內(nèi)、門靜脈與股靜脈三種途徑同種異體移植的比較,肝內(nèi)移植途徑效果最好。
　　 三、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠外科肝損傷的修復(fù)與體內(nèi)示蹤的研究
　　 目的:探討骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠外科肝損傷的修復(fù)作用及其在活體肝臟內(nèi)分布和定居的示蹤情況。
　　 方法:選用8周齡SD大鼠40只,隨機(jī)分成移植組和對(duì)照組,每組20只。所有大鼠均按照第一部分的實(shí)驗(yàn)方法建立大鼠外科肝損傷模型,移植組同時(shí)取菲立磁標(biāo)記的濃

15、度為1×106/ml的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞1 ml,緩慢注射到大鼠肝右葉內(nèi);對(duì)照組在相同部位注射等量的生理鹽水。兩組大鼠分別于術(shù)后12h、1d、3d、5d、7d、14d通過右頸靜脈采血2.5 ml,離心,取血漿1 ml,分別檢測和比較兩組大鼠AST、ALT、ALP、TB和DBIL指標(biāo),并用MRI對(duì)兩組大鼠的肝臟進(jìn)行掃描,于術(shù)后14 d普魯士藍(lán)染色兩組大鼠肝臟組織切片,光鏡觀察肝臟的病理變化。
　　 結(jié)果:移植組大鼠在術(shù)后12h、1d、

16、3d、5d、7d、14d MRI均能檢測到肝臟移植部位橢圓形低信號(hào)區(qū),低信號(hào)范圍隨時(shí)間的延長逐漸擴(kuò)大,信號(hào)強(qiáng)度逐漸升高,而對(duì)照組大鼠在術(shù)后12h MRI可檢測到肝臟移植部位的高信號(hào)區(qū),此后肝內(nèi)高信號(hào)區(qū)消失;移植組大鼠的ALT指標(biāo)在移植后1d、3d、5d均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),AST、TB指標(biāo)在移植后12h、1d、3d、5d均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),ALP、DBIL指標(biāo)在移植后12h、1d、3d、5d、7d均顯著低于對(duì)照