骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的磁性標(biāo)記示蹤及丹酚酸B鹽協(xié)同間質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠脊髓損傷的研究.pdf

1、干細(xì)胞包括胚胎千細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體T細(xì)胞，這類細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)和快速增殖，同時(shí)具有向自我更新和多向分化潛能，是目前多種疾病實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療的熱點(diǎn)。干細(xì)胞移植后能夠分泌治療性物質(zhì)，并可能修復(fù)和替代損傷性疾病中受損的神經(jīng)組織。因此，干細(xì)胞移植為脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病帶來了希望。骨髓間質(zhì)千細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是成體干細(xì)胞的一種，獲取簡(jiǎn)單，擴(kuò)增

2、容易，可在體外和體內(nèi)向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，受到研究者更多的重視。 脊髓損傷(spinal cord injures，SCI)是臨床常見疾病，給患者帶來了極大痛苦，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。脊髓損傷的藥物治療受限于有限的藥物種類和狹窄的治療時(shí)間窗，康復(fù)治療的效果也不能令人滿意。目前，研究者更多將目光轉(zhuǎn)向干細(xì)胞移植治療脊髓損傷，MSCs自然受到研究者的青睞。本室對(duì)MSCs單獨(dú)或結(jié)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及嗅鞘細(xì)胞治療脊髓損傷的療效和機(jī)制進(jìn)行探討，

3、肯定了MSCs治療脊髓損傷的有效性。 然而，MSCs治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用也遇到和其他細(xì)胞移植同樣的問題：首先是用來區(qū)分宿主細(xì)胞與移植細(xì)胞的傳統(tǒng)標(biāo)記和識(shí)別方法只能在離體情況下進(jìn)行，顯然，這些方法用于大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者臨床研究時(shí)不可行。所以有必要尋找能夠在體示蹤檢測(cè)和追蹤移植細(xì)胞命運(yùn)的方法。將需要移植的細(xì)胞進(jìn)行磁性對(duì)比劑標(biāo)記，通過磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行可視化追蹤

4、，就能得知移植細(xì)胞在體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)信息以及未來命運(yùn)。釓-二亞甲基三胺五乙酸-葉酸(Gadolinium diethylenetriaminepentaacetic acid，Gd-DTPA)是一種T1造影劑，和鐵劑類T2造影劑一樣可用于細(xì)胞標(biāo)記。Gd-DTPA相比其他造影劑用于細(xì)胞標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)在于其較少受到血流和周圍其他正常和非正常組織結(jié)構(gòu)信號(hào)的影響。那么，能否用Gd-DTPA標(biāo)記MSCs來進(jìn)行MSCs的在體MRI示蹤?這是本課題要探討的一個(gè)

5、重要內(nèi)容。另外一個(gè)問題是成年個(gè)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)，尤其是損傷的CNS很可能不利于移植細(xì)胞的存活。即使是在細(xì)胞最好的狀態(tài)下進(jìn)行移植，據(jù)報(bào)道最多能有10﹪的移植細(xì)胞存活，而能夠分化成為成熟神經(jīng)元的移植細(xì)胞則更少。雖然在脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究中，很多研究者建議細(xì)胞移植時(shí)間窗應(yīng)選在損傷后7-10天，但有證據(jù)表明存活細(xì)胞數(shù)量仍不樂觀。大部分細(xì)胞治療用于打擊性或壓迫性脊髓損傷是采用髓內(nèi)注射的方式，而注

6、射器的刺入很可能對(duì)受損脊髓造成又一次大的損害。脊髓損傷后的微環(huán)境和隨后注射造成的損害中，腫瘤壞死因子-α(tIJmor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子及其引起的一系列炎癥反應(yīng)是一種重要因素。丹酚酸B鹽(Salvianolic acid B，SalB)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參(salvia miltiorrhiza，Danst]en)的水溶性有效成分，已有研究證明Sal B具有很強(qiáng)的抗氧化作用和明顯的抗炎作用。還有研

7、究表明，復(fù)方丹參注射液可以用于治療脊髓損傷。那么，應(yīng)用Sal B能否促進(jìn)移植的MSCs的存活呢?這是本課題要研究的又一重要內(nèi)容。 綜上所述，本研究擬采用帶有紅色熒光的陽離子轉(zhuǎn)染試劑jetPEI-FluoR負(fù)載的Gd標(biāo)記MSC(Gd-MSCs)，觀察Gd標(biāo)記對(duì)MSCs存活和增殖能力的影響，電鏡檢測(cè)Gd在MSCs內(nèi)的分布情況，并對(duì)移植到大鼠脊髓損傷節(jié)段的Gd-MSCs進(jìn)行MRI活體示蹤；觀察Sal B的神經(jīng)保護(hù)作用以及是否在體外保護(hù)

8、MSCs不受TNF-α的損傷，觀察Sal B是否能促進(jìn)移植到受損脊髓的MSCs的存活及兩者聯(lián)合應(yīng)用后脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。 本實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容由以下兩部分組成： 第1部分：骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的磁性標(biāo)記示蹤 目的：觀察Gd-DTPA成功標(biāo)記MSCs后對(duì)其生物學(xué)特性的影響，觀察MSCs中Gd-DTPA的分布情況，MRI示蹤植入到脊髓損傷大鼠體內(nèi)的MSCs，探討Gd-DTPA標(biāo)記MSCs的方法用于脊髓損傷研究的可行

9、性。 方法：接種培養(yǎng)大鼠MSCs，用陽離子轉(zhuǎn)染試劑jetPEI-FluoR結(jié)合Gd-DTPA標(biāo)記MSCs。透射電鏡觀察Gd-DTPA在MSCs胞膜和胞漿的分布情況，MRI觀察標(biāo)記后MSCs的信號(hào)強(qiáng)度變化。用臺(tái)盼藍(lán)染色、MTT比色法和Hochest 33342染色法檢測(cè)Gd-DTPA標(biāo)記對(duì)MSCs的存活、增殖及凋亡的影響。移植標(biāo)記的MSCs到脊髓損傷大鼠受損脊髓節(jié)段內(nèi)，然后用MRI觀察MSCs的分布和遷移情況，并用組織學(xué)方法驗(yàn)證。

10、同時(shí)BBB評(píng)分評(píng)價(jià)標(biāo)記的MSCs對(duì)脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)情況。 結(jié)果： 1．Gd-DTPA能夠成功標(biāo)記MSCs，且標(biāo)記效率不低于80﹪。Gd-DTPA標(biāo)記的MSCs在1.5T核磁共振掃描圖像上清晰可見，標(biāo)記的MSCs在T1加權(quán)圖像上的信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。透射電鏡證實(shí)Gd-DTPA存在于MSCs內(nèi)。 2．Gd-DTPA標(biāo)記不影響細(xì)胞存活、增殖和凋亡。 3．標(biāo)記的MSCs在細(xì)胞移植后14天仍能夠檢測(cè)到信號(hào)強(qiáng)度的

11、明顯變化。標(biāo)記細(xì)胞相對(duì)周圍脊髓組織的信號(hào)強(qiáng)度增高在第1，3，7，14天分別為26.61﹪，22.81﹪。19.88﹪，14.42﹪。但是，到了移植后第21天，信號(hào)強(qiáng)度增高只有8.77﹪。MRI上，標(biāo)記MSCs從注射處向損傷區(qū)遷移，并且在移植后第14天和第21天，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在損傷區(qū)以外區(qū)域出現(xiàn)，組織學(xué)結(jié)果也證實(shí)這一點(diǎn)。 4．標(biāo)記MSCs和未標(biāo)記MSCs移植的脊髓損傷大鼠的BBB評(píng)分從移植第7天開始比對(duì)照組的大鼠的評(píng)分高(P(0.

12、05)，而兩者之間則沒有顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：Gd-DTPA可有效標(biāo)記MSCs；MRI可在體示蹤移植到大鼠脊髓損傷節(jié)段的Gd-DTPA-MSCs，標(biāo)記細(xì)胞集中分布在損傷區(qū)域。Gd-DTPA-MSCs的MRI示蹤可能是闡明MSCs治療脊髓損傷和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病作用機(jī)制的重要示蹤方法。 第2部分：丹酚酸B鹽協(xié)同間質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠脊髓損傷 目的：觀察Sal B對(duì)脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，觀察Sal B是否

13、保護(hù)MSCs不受TNF-α的損害，以及是否能促進(jìn)移植的MSCs在損傷脊髓的存活數(shù)量，探討聯(lián)合應(yīng)用Sal B和MSCs治療大鼠脊髓損傷的可行性。 方法：體外培養(yǎng)大鼠MSCs，觀察Sal B對(duì)MSCs在TNF-α存在條件下的存活的影響?？斩疵娣e分析和BBB評(píng)分觀察Sal B對(duì)大鼠脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。大鼠脊髓損傷后第7天，移植5-溴脫氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)標(biāo)記的MSCs，并腹腔注射Sal B。

14、采用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況：細(xì)胞注射后7天和28天進(jìn)行灌注取材，免疫組織化學(xué)染色觀察移植的MSCs的存活情況，觀察Sal B促進(jìn)移植的MSCs存活的作用。 結(jié)果： 1．分別用TNF-α或TNF-α聯(lián)合丹SalB處理MSCs，觀察其對(duì)MSCs存活的影響。10ng/ml TNF-α作用24小時(shí)后MSCs大部分邊緣翹起，呈半漂浮狀；而100ng/mlSalB存在時(shí)，TNF-α對(duì)MSCs幾乎沒有影響。 2．

15、SalB可以顯著減小損傷大鼠脊髓的空洞面積(P<0.05)，從脊髓損傷后第14天起，SalB和PBS對(duì)照治療組之間的BBB評(píng)分有顯著差異(P<0.05)。 3．MSCs和SalB聯(lián)合應(yīng)用組的大鼠損傷部位有很多存活的MSCs聚集，而單純MSCs組的細(xì)胞存活則比較少。存活細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果表明在移植后的第7天和28天，聯(lián)合應(yīng)用組的MSCs存活數(shù)量都比單獨(dú)MSCs應(yīng)用組要多(P<0.5)。聯(lián)合應(yīng)用組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)要比單純MSCs恢復(fù)

16、的要好(P<0.5)。 結(jié)論：SalB可以減少脊髓損傷空洞形成。SalB在體外保護(hù)MSCs免受TNF-α的毒性作用，在體內(nèi)促進(jìn)移植的MSCs的存活；聯(lián)合應(yīng)用MSCs和SalB能更好地促進(jìn)脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)。 總結(jié) 通過以上實(shí)驗(yàn)研究，可得到以下結(jié)果： 1．Gd—DTPA能有效標(biāo)記MSCs并且不影響MSCs的牛物學(xué)特性； 2．Gd—DTPA標(biāo)記的MSCs在移植后14天內(nèi)可用MRI活體示蹤；