骨髓間質(zhì)干細胞標記及再生腎樣細胞的研究.pdf

1、目的：建立PKH26、DAPI標記骨髓間質(zhì)干細胞(mesenchymalstem cell，MSC)，的方法，并探討標記MSC的基本生物學活性；SD大鼠經(jīng)50％的甘油肌內(nèi)注射建立大鼠急性腎功能衰竭(acute renalfailure，ARF)模型，評價經(jīng)尾靜脈注射的MSC對大鼠APF的治療效果及體內(nèi)外初步探討其可能機制。 方法: MSC按PKH26、DAPI標記程序進行標記后培養(yǎng)，采用激光共聚焦顯微鏡(confocol)、流式

2、細胞分析儀(FCM)等觀察細胞生長狀態(tài)和熒光標記活性變化；應(yīng)用RT-PCR檢測標記后MSC的mucleostemin及Bmi-1基因的表達；選用堿性磷酸酶(ALP)染色、von kossa染色及骨形成蛋白3(BMP3)基因表達分析等技術(shù)，觀察標記后MSC體外分化成骨細胞的特性；SD大鼠經(jīng)50％的甘油肌內(nèi)注射建立大鼠ARF模型，尾靜脈注射MSC，綜合運用臨床生物化學、分子生物學、免疫組織化學、病理學、熒光原位雜交(FISH)等技術(shù)，評價M

3、SC的治療效果并找尋修復腎損傷的機制。體外利用Transwell培養(yǎng)板將大鼠MSC與受損腎組織共培養(yǎng)，運用confocol、RT-PCR、巢式PCR、熒光定量PCR鑒定細胞是否能分化為腎小管樣上皮細胞，進一步佐證MSC的治療修復機制。 結(jié)果: PKH26標記后細胞呈紅色熒光，DAPI標記的細胞核呈藍色熒光，熒光的強度隨著熒光染料濃度的增加而遞增，并與傳代時間和代數(shù)相關(guān)；標記后細胞生長狀態(tài)良好，基本生長特性如傳代培養(yǎng)和生長曲線無明

4、顯改變；細胞nucleostemin及Bmi-1基因表達未見改變；標記MSC誘導后ALP、Von kossa染色陽性，呈現(xiàn)典型的成骨細胞形態(tài)和生物學特征，并表達：BMP3基因；成功建立大鼠ARF模型，ARF大鼠腎組織內(nèi)具有較多的外源MSC，其他組織如心、肝、肺、腦也可見少量的外源MSC；利用胎兒MSC進行的定位實驗中，在大鼠的心、肝及不同腎臟部位擴增出人17α衛(wèi)星DNA序列。FISH實驗顯示大鼠冰凍腎臟切片中可見人源性細胞。MSC實驗組

5、大鼠血清肌酐、尿素氮下降水平較對照組具有明顯的差異(P<0.05)。實驗組大鼠腎臟恢復情況較對照組有明顯改善。體外共培養(yǎng)后，大鼠MSC形態(tài)由長梭形變?yōu)閳A形，并且高表達上皮細胞特異性基因CK18和腎小管上皮細胞特異性基因AQP1。結(jié)論 PKH26、DAPI可穩(wěn)定標記大鼠骨髓MSC并能傳代培養(yǎng)，標記后細胞形態(tài)、生長活力及多向分化潛能等無明顯影響，該技術(shù)可用于追蹤MSC轉(zhuǎn)歸、可塑性及干細胞移植方面的實驗研究；外源MSC體內(nèi)能夠歸巢到受損腎臟，