microRNA在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的急性腎損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、目的：探討大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，rMSCs)在順鉑誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷(acutekidneyinjury，AKI)中通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵microRNA(miRNA)的表達(dá)從而發(fā)揮修復(fù)作用。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)移植AKI大鼠，觀察rMSCs對(duì)損傷腎的修復(fù)作用;miRNA芯片比較篩選出在rMSCs組與PBS組中表達(dá)差異的miRNAs分子，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并探尋rMSCs修復(fù)腎損傷

2、中的關(guān)鍵miRNAs，揭示rMSCs修復(fù)腎損傷的可能分子機(jī)制。
　　 方法：以6mg/kg劑量的順鉑經(jīng)腹腔注射到大鼠體內(nèi)，建立急性腎損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。于順鉑注射后的24h以尾靜脈注射方式將2×106rMSCs輸注到大鼠體內(nèi)，并分別在損傷不同時(shí)間點(diǎn)收集大鼠的血液，檢測(cè)血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平來(lái)評(píng)價(jià)MSC對(duì)腎功能的改善情況，通過(guò)活體成像觀察rMSCs的組織定位。于順鉑注射后5d處死大鼠，留取腎組織標(biāo)本，HE染色觀察rMS

3、Cs對(duì)腎組織的修復(fù)作用，WesternBlot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)，TUNEL染色檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡情況，綜合評(píng)價(jià)間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性腎損傷的修復(fù)作用。在此基礎(chǔ)上，留取正常大鼠（對(duì)照組），急性腎損傷輸注PBS大鼠（PBS組）以及輸注rMSCs的大鼠（rMSCs組）的腎組織進(jìn)行microRNA芯片分析。經(jīng)芯片比較篩選，選取rMSCs組與PBS組差異顯著的miRNAs分子，經(jīng)qRT-

4、PCR檢測(cè)并驗(yàn)證這些miRNAs分子在體內(nèi)外模型中的表達(dá)情況。在體內(nèi)外模型中差異變化一致的miRNAs，進(jìn)一步研究其下游靶基因及相關(guān)信號(hào)通路，探討rMSCs修復(fù)腎損傷中可能的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：體內(nèi)活體成像結(jié)果顯示經(jīng)尾靜脈注射的rMSCs能夠到達(dá)損傷的大鼠腎組織，rMSCs移植組的BUN、Cr水平較PBS組有明顯的下降(P＜0.05)，病理HE染色結(jié)果顯示rMSCs移植組的腎組織結(jié)構(gòu)比較完整、蛋白管型減少，免疫組織化學(xué)與TU

5、NEL染色結(jié)果揭示rMSCs能顯著增加損傷部位的腎小管上皮細(xì)胞的增殖，減少腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，WesternBlot顯示rMSCs移植組的Bax表達(dá)下調(diào)，Bc1-2的表達(dá)上調(diào)。microRNA芯片分析顯示部分miRNAs分子在PBS組較正常對(duì)照組的表達(dá)顯著增高或降低，而rMSCs可以逆轉(zhuǎn)相應(yīng)miRNAs分子的表達(dá)。選取miR-92b，miR-146b，miR-150*與miR-455進(jìn)行驗(yàn)證，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示miR-146b

6、在體內(nèi)外模型中變化一致且與芯片結(jié)果相符，初步選取miR-146b進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)。WesternBlot進(jìn)一步檢測(cè)了miR-146b的靶基因表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在各組中的表達(dá)，結(jié)果顯示在PBS組由于miR-146b高表達(dá)，EGFR的表達(dá)較低，而rMSCs降低了miR-146b的表達(dá)，導(dǎo)致EGFR蛋白表達(dá)增加，從而調(diào)控其下游Akt相關(guān)蛋白通路，在腎損傷中發(fā)揮修復(fù)作用。
　　 結(jié)論：rMSCs的移植對(duì)急性腎損傷具有修復(fù)作用，