VEGF基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)人早胚間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)急性腎損傷的作用研究.pdf

1、目的:急性腎損傷(AKI)是臨床的常見疾病，重癥死亡率達(dá)50％-80％。雖然在急性腎衰竭的發(fā)病機(jī)制和治療上進(jìn)行了諸多研究，但是到目前為止治療的手段仍然有限，唯一可選擇的治療方法為透析治療和在等待腎功能恢復(fù)過程中的支持治療，尋找更有效地治療AKI的方法一直是努力的方向。
　　 干細(xì)胞的定義為具有自我更新和多向分化潛能的克隆細(xì)胞，干細(xì)胞在治療急性腎損傷方面有廣闊的前景，已有多項研究證實干細(xì)胞對于急性腎損傷有治療作用。MSC是目前最常

2、用于研究發(fā)育以及疾病治療的干細(xì)胞，其中又以成體骨髓來源MSC最為多見，隨著研究的深入，MSC的來源日益增多，比如成體或者胚胎，胎兒組織，臍血等。由于干細(xì)胞的來源不同，各自分化，增生能力亦有差別，到目前為止尚不知道何種干細(xì)胞作為治療疾病或新藥研究是最佳的。成體骨髓MSC來源廣泛，但是使用這一細(xì)胞也有其局限性，MSC在成人骨髓內(nèi)含量極低，約占有核細(xì)胞數(shù)的0.001-0.0001％，并且骨髓MSC的數(shù)量和分化能力隨著所以年齡的增長而減少和減弱

3、。與成體MSC相比，胚胎組織來源的MSC增殖和分化能力強(qiáng)，免疫原性弱，所以使用胚胎來源干細(xì)胞作為干細(xì)胞的研究有其獨特的優(yōu)越性。目前從人早期胚胎中分離MSC的研究國內(nèi)外研究較少。
　　 關(guān)于干細(xì)胞修復(fù)急性腎損傷的機(jī)制以往認(rèn)為是通過直接轉(zhuǎn)化為小管上皮細(xì)胞，目前認(rèn)為小管再生主要通過殘存細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)分化，僅有很少的外源干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腎小管上皮細(xì)胞。MSC的腎保護(hù)作用主要通過旁分泌作用，分泌細(xì)胞因子抗調(diào)亡，促分裂，免疫調(diào)節(jié)和促血管生成。通

4、過對干細(xì)胞的旁/自分泌作用的深入了解，將以干細(xì)胞分泌功能作為調(diào)節(jié)干細(xì)胞保護(hù)的新靶點提供依據(jù)。
　　 VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)新生血管形成和側(cè)支循環(huán)開放等作用。VEGF對于維持腎小球功能起關(guān)鍵作用，可以刺激間質(zhì)血管生成，小管增值并且直接保護(hù)腎臟上皮細(xì)胞。最近有研究MSC經(jīng)過RNA干擾后VEGF表達(dá)下降，急性缺血再灌注小鼠給予干擾后MSC后，與給予干擾MSC的小鼠比，腎臟修復(fù)明顯減低

5、，生存率下降，這說明，VEGF是MSC腎臟保護(hù)作用中重要的因子。
　　 因此我們準(zhǔn)備以調(diào)節(jié)干細(xì)胞分泌VEGF為切入點，提高干細(xì)胞對AKI的治療效果。本實驗采用體外順鉑損傷腎小管上皮細(xì)胞模型和體外順鉑誘導(dǎo)的裸鼠急性腎損傷模型觀察VEGF基因轉(zhuǎn)染對于hMSC修復(fù)急性腎損傷的作用，并對其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 方法：
　　 一、VEGF基因轉(zhuǎn)染人早胚間充質(zhì)干細(xì)胞
　　 選擇攜帶VEGF165基因的重組腺病毒(Ad

6、.VEGF165病毒顆粒由張裕東博士饋贈)轉(zhuǎn)染hMSC，并使用攜帶GFP基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染hMSC確定最佳的轉(zhuǎn)染滴度。
　　 實驗結(jié)果顯示：腺病毒介導(dǎo)的GFP基因?qū)τ趆MSC具有較高的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率與病毒滴度(MOI)具有量效關(guān)系。病毒MOI為50時，轉(zhuǎn)染效率＞70％，轉(zhuǎn)染后hMSC的生長曲線與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相似。轉(zhuǎn)染VEGF后，hMSC可有效表達(dá)VEGF,4-6天時達(dá)峰，14天左右恢復(fù)正常。
　　 腺病毒介導(dǎo)的VEG

7、F基因可以安全、有效的轉(zhuǎn)染hMSC，其攜帶的VEGF基因可獲得較高的表達(dá)水平。
　　 二、VEGF基因轉(zhuǎn)染的hMSC對順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)作用
　　 使用10 uM順鉑預(yù)處理TCMK-1后24小時，TCMK-1分為正常組、hMSC+順鉑+TCMK-1共培養(yǎng)組、VEGF轉(zhuǎn)染hMSC+順鉑+TCMK-1共培養(yǎng)組、空載體轉(zhuǎn)染hMSC+順鉑+TCMK-1共培養(yǎng)組和順鉑+TCMK-1組。結(jié)果顯示：與正常組相比，TCM

8、K-1經(jīng)過順鉑預(yù)處理后3天增值明顯減慢，凋亡增加，PCNA表達(dá)增強(qiáng)(p＜0.01)。與未共培養(yǎng)組相比，順鉑預(yù)處理后TCMK-1與各干細(xì)胞共培養(yǎng)均能緩解順鉑對TCMK-1的生長抑制，減少凋亡，促進(jìn)PCNA的表達(dá)(p＜0.01)；尤其以VEGF轉(zhuǎn)染hMSC共培養(yǎng)組最明顯(p＜0.01 versus cisplatin+TCMK-1+AD-hMSC，cisplatin+TCMK-1+hMSC)。
　　 本部分實驗證實：VEGF轉(zhuǎn)染hM

9、SC和以提高h(yuǎn)MSC對順鉑損傷TCMK-1的修復(fù)作用，機(jī)制可能與增加hMSC促增殖和抗調(diào)亡有關(guān)。
　　 三、VEGF基因轉(zhuǎn)染的hMSC對順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI的修復(fù)作用
　　 選取6-8周齡的BALB/C雄性裸鼠，按18mg/kg經(jīng)小鼠腹腔注射順鉑，建立藥物性急性腎損傷小鼠模型。動物分組：A組(正常對照組)；B組(生理鹽水治療組)：注射生理鹽水；C組(VEGF-hMSC組)：注射體外轉(zhuǎn)染Ad.CMV-VEGF165的hMS

10、C；D組(AD-hMSC)：注射體外轉(zhuǎn)染Ad.CMV-con的hMSC；E組(hMSC組)：注射hMSC。藥物注射后第4天，小鼠腎臟病理解剖結(jié)果腎小管上皮細(xì)胞呈空泡變性，部分細(xì)胞壞死脫落入管腔，基底膜暴露；小鼠血中BUN，SCr升高。C組、D組和E組HE染色壞死小管計數(shù)，管型計數(shù)以及血清BUN，SCr均低于B組，以C組的檢測指標(biāo)降低最明顯。與正常腎臟相比急性腎損傷后各組中腎臟PANC和TUNEL染色計數(shù)增加，C組、D組和E組PCNA計數(shù)

11、均高于B組而TUNEL計數(shù)低于B組，其中C組的PCNA計數(shù)最高，TUNEL計數(shù)最低。與正常腎臟相比急性腎損傷后各組中腎臟腎小管周圍CD34染色血管面積減少，C組、D組和E組CD34染色血管面積均高于B組，其中C組染色面積最高。PKH-26標(biāo)記的hMSC大多定位于肺、肝、脾，腎臟僅看到很少量的干細(xì)胞，并且在VEGF轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染組沒有區(qū)別。
　　 在本部分實驗中，我們成功的建立了順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷裸鼠模型，VEGF基因轉(zhuǎn)染可以提高

12、hMSC對急性腎損傷的修復(fù)作用，具體機(jī)制與VEGF基因轉(zhuǎn)染可以提高干細(xì)胞的促增值，抗凋亡和保護(hù)血管微環(huán)境的作用有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 綜合三部分結(jié)果，我們可以得出結(jié)論，使用VEGF腺病毒基因轉(zhuǎn)染可以有效上調(diào)hMSC的VEGF水平。上調(diào)hMSC的VEGF水平可以增加hMSC的對受損腎小管上皮的保護(hù)作用，其機(jī)制與增加干細(xì)胞的促增值，抗凋亡和保護(hù)血管內(nèi)皮功能有關(guān)。本研究為臨床使用新的干細(xì)胞來源提供了基礎(chǔ)，驗證了關(guān)于提高干細(xì)