腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉染大鼠骨髓基質細胞的實驗研究.pdf

1、目的: 探討B(tài)DNF基因轉染大鼠骨髓基質細胞BDNFmRNA、BDNF蛋白表達情況以及轉染基因對其分化的影響。評價對大鼠骨髓基質細胞進行BDNF基因轉染的可行性。 方法: 1、細胞培養(yǎng)：采用密度梯度離心法分離出大鼠BMSCs，在DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)擴增； 2、細胞分組：將第三代BMSCs以1×106個/L的密度接種到6孔板。在細胞生長至80％融合時，隨機分成未轉染組、空載體轉染組、BDNF轉染組，每組4孔。

2、 3、基因轉染：BDNF轉染組按標準方法以2μg PcDNA3.1-BDNF:6μl陽離子聚合物轉染細胞；空載體轉染組以2μg PcDNA3.1:6μl陽離子聚臺物轉染細胞；未轉染組繼續(xù)在原培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。 4、BDNF蛋白表達測定：轉染后24h，進行BDNF免疫細胞化學染色，光學顯微鏡計數(shù)BDNF染色陽性細胞數(shù)，結果用均數(shù)±標準差表示。 5、BDNFmRNA表達檢測：轉染后24h，各組BMSCs利用逆轉錄-聚合酶

3、鏈反應(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測BDNF mRNA的表達。 6、BDNF蛋白表達時效性測定：分別在轉染后1、3、5、7、9、11、13、15d收集培養(yǎng)液上清，利用ELISA檢測培養(yǎng)液上清中BDNF蛋白含量。 7、BMSCs分化鑒定：轉染后15d，進行NSE和GFAP免疫細胞化學染色，光學顯微鏡計數(shù)NSE和GFAP染色陽性細胞數(shù)，結果

4、用均數(shù)±標準差表示。 8、統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)。 結果: 采用密度梯度離心法成功分離出BMSCs，并在體外大量擴增培養(yǎng)；轉染后24h，BDNF轉染組有大量BDNF染色陽性細胞，未轉染組和空載體轉染組BDNF染色陽性細胞極少，與BDNF轉染組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。未轉染組和空載體轉染組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)：三組細胞RT-PCR均擴增出了約780bp的基因片段，條帶光密度BDNF轉染組高于未轉染組和空

5、載體轉染組(P<0.01)，未轉染組和空載體轉染組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；BDNF轉染組在轉染1d后BDNF蛋白即開始表達，5～9d升高趨勢明顯，11～15d升高趨勢減緩，但BDNF蛋白表達量能夠維持在較高水平。未轉染組和空載體轉染組也表現(xiàn)出隨著時間變化，BDNF蛋白表達量升高趨勢。但在各時間點BDNF蛋白表達量均明顯低于BDNF轉染組(配對t檢驗，P<0.01)。未轉染組和空載體轉染組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；轉