IFN-γ啟動子熒光素酶報告系統(tǒng)的建立及其在篩選結核分枝菌蛋白調控IFN-γ表達中的作用.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病。結核病的疫情仍然非常嚴重，已成為目前全球最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)WHO估計，全球約有1/3的人感染結核分枝桿菌，2012年有860萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)為130萬。結核分枝桿菌感染宿主后會引起宿主的免疫應答反應并產生多種細胞因子。其中IFN-γ是抵抗結核分枝桿菌感染最主要的細胞因子。IFN-γ是一種Ⅱ型干擾素主要由活化T細胞、NK細胞產生，能激活巨噬細胞對結核分枝桿菌的清除具有重要意義。因此

2、本實驗主要是研究對IFN-γ具有調控作用的結核分枝桿菌蛋白。
　　1.候選蛋白的選擇
　　本實驗以結核分枝桿菌H37Rv株為研究對象篩選出一些可能對IFN-γ具有調控作用的結核分枝桿菌脂蛋白，膜蛋白和分泌蛋白。通過生物信息學方法和結核分枝桿菌蛋白質組學的綜合考慮本實驗共選取了173個蛋白基因作為候選基因。針對這些蛋白的目的基因序列設計出使引物所帶有的酶切位點盡量相同PCR的引物。
　　2.候選蛋白真核表達質粒的構建

3、r>　　本實驗以結核分枝桿菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增。然后將克隆得到的目的基因連接至pcDNA3.1-V5/HisB載體中，構建了相關蛋白的真核表達質粒173個。由于本實驗需要構建大量的真核表達質粒，因此采用了一些使實驗簡便的方法。首先將酶切位點相同的目的基因同時進行PCR，然后將PCR產物與目的載體同時酶切回收。接下來測定回收產物的濃度，將各種目的基因的濃度調節(jié)一致混合之后同時與載體連接。將連接產物轉化，挑取一定數(shù)量的單菌落

4、搖菌、小提質粒、酶切鑒定和送測序。最后通過序列比對挑選出構建成功的質粒。
　　3.調控IFN-γ啟動子活性的結核分枝桿菌蛋白的篩選
　　由于本實驗采用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)進行篩選，因此需要構建IFN-γ啟動子熒光素酶報告質粒。對IFN-γ啟動子進行預測之后，設計出擴增IFN-γ啟動子的引物。本實驗以提取的Hela細胞的基因組為模板成功擴增得到了大小為602bp人源IFN-γ啟動子的目的基因并將目的基因連接到pGL3-Basic

5、載體上從而成功構建了IFN-γ啟動子的pGL3-Basic熒光素酶報告質粒。
　　將所成功構建的173個結核分枝桿菌蛋白的真核表達質粒分別與IFN-γ啟動子熒光素酶報告質粒共轉染Hela細胞進行雙熒光素酶的檢測。通過篩選得到部分對IFN-γ啟動子具有調控作用的蛋白，其中蛋白Rv0720對IFN-γ啟動子具有一定的抑制作用并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性;蛋白Rv3623對IFN-γ啟動子具有一定的刺激作用并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　

6、4.對候選蛋白在蛋白水平的研究
　　為了研究結核分枝桿菌蛋白在蛋白質水平對IFN-γ的調控本實驗首先選擇了對IFN-γ啟動子具有明顯調控作用的蛋白Rv0720、Rv3623。蛋白Rv3763與蛋白Rv0720、Rv3623都屬于膜磷脂蛋白，同時已有文獻報道對蛋白Rv3763進行研究發(fā)現(xiàn)該蛋白具有誘導細胞凋亡的作用。因此雖然本實驗在雙熒光素酶的檢測中發(fā)現(xiàn)蛋白Rv3763對IFN-γ啟動子的調控作用較弱，但仍然想在蛋白質水平研究該蛋白