樹鼩IFN-γ的克隆及原核表達(dá)系統(tǒng)的建立.pdf

1、目的：
　　1.克隆樹鼩γ干擾素分子。
　　2.建立樹鼩γ干擾素原核表達(dá)系統(tǒng)。
　　方法：
　　1.以樹鼩PBMCcDNA為模板,用兩對(duì)引物分別采用PCR法,擴(kuò)增樹鼩IFN-γCDS區(qū)序列。
　　2.構(gòu)建樹鼩IFN-γ-pRSETB原核表達(dá)載體,并將載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)PlysS菌中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組IFN-γ蛋白。
　　結(jié)果：
　　1、以樹鼩外周血單核細(xì)胞為模板,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物IFN

2、-P1/IFNP3、IFN-P2/IFNP10,分別采用PCR擴(kuò)增出IFN-γ片段為約344bp和476bp.將兩段PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果綜合,得到509bp核苷酸序列。將此序列與人類IFN-γ序列比對(duì),證實(shí)樹鼩與人類IFN-γ分子間具備較高同源性。
　　2、將429bpIFN-γ編碼區(qū)片段(不含信號(hào)肽序列)連接表達(dá)載體pRSET-B,測(cè)序結(jié)果證明載體構(gòu)建成功。
　　3、重組質(zhì)粒IFN-γ-pRSETB在BL21(DE3)Ply

3、sS菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo),以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)westernblot分析,證實(shí)為約18KD的重組蛋白。
　　結(jié)論：
　　1、成功克隆獲得樹鼩γ干擾素CDS區(qū)核苷酸序列。
　　2、成功構(gòu)建樹鼩IFN-γ原核表達(dá)質(zhì)粒IFN-γ-pRSETB,并且在BL21(DE3)PlysS菌中誘導(dǎo)表達(dá)。
　　本研究意義：
　　本研究成功克隆樹鼩γ干擾素CDS區(qū)核苷酸序列,成功構(gòu)建樹鼩IFN-γ原核表達(dá)質(zhì)粒IFN-γ-pRSET