調(diào)控IFN-γ的microRNA篩選及作用機制研究.pdf

1、免疫系統(tǒng)是生物體抵抗外來微生物入侵的第一道防線，干擾素是免疫應答過程中的重要效應因子。Interferon-γ(IFN-γ)屬于Ⅱ型干擾素，主要由活化的T淋巴細胞、NK細胞產(chǎn)生，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用，特別是對胞內(nèi)寄生菌的感染具有顯著抑制效果。microRNA(miRNA)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)且長度在18-25bp之間的非編碼RNA。近十年來，大量研究表明miRNA參與對機體免疫系統(tǒng)的調(diào)控，對維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)起著舉足

2、輕重的作用。本研究選取重要的免疫細胞因子IFN-γ作為研究對象，利用生物信息學方法和生物學實驗，對可能參與調(diào)控IFN-γ表達的miRNA進行了篩選和驗證，希望通過本研究能夠系統(tǒng)闡述miRNA對IFN-γ表達多層次的調(diào)控機制，加深對miRNA調(diào)控IFN-γ介導的免疫應答過程中作用機制的認識，同時為進一步開發(fā)miRNA作為疾病診斷和治療的新靶標提供理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　1.靶向IFN-γ啟動子及其3'UTR的m

3、iRNA的預測
　　利用在線miRNA預測軟件Microinspector和TargetScan分別對IFN-γ轉(zhuǎn)錄起始位點上游的1197bp序列及3'UTR的583bp序列進行分析，預測到可能靶向IFN-γ啟動子區(qū)域的miRNA50條，可能靶向IFN-γ3'UTR的miRNA11條。根據(jù)miRBase公布的miRNA序列信息，從預測結(jié)果中選取8條可能靶向IFN-γ啟動子區(qū)域的miRNA和10條可能靶向3'UTR的miRNA合成m

4、imics及inhibitors。
　　2.報告質(zhì)粒的構(gòu)建
　　將PCR擴增獲得的IFN-γ轉(zhuǎn)錄起始位點上游的1197bp片段和3'UTR的583bp片段分別連接到pGL3-Basic和pMIR-REPORT載體上，成功構(gòu)建了IFN-γ啟動子報告質(zhì)粒pGL3-TSS1197和3'UTR報告質(zhì)粒pMIR-IFNG-3'UTR。
　　3.調(diào)控IFN-γ表達的miRNA的篩選及驗證
　　將合成的miRNAmimics分

5、別與IFN-γ啟動子報告質(zhì)粒pGL3-TSS1197共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)篩選到能抑制IFN-γ啟動子活性的miR-27a。同時將合成的miRNAmimics分別與IFN-γ3'UTR報告質(zhì)粒pMIR-IFNG-3'UTR共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)篩選到miR-27a能夠與IFN-γ3'UTR結(jié)合并具有負調(diào)控作用，并利用miRNAinhibitors對miR-27a的負調(diào)控作用進行了驗

6、證。進一步利用相應靶點突變報告質(zhì)粒，確定了miR-27a結(jié)合IFN-γ啟動子及3'UTR的靶點。
　　4.miR-27a抑制T細胞中IFN-γ表達
　　為了進一步在T細胞中探究miR-27a對IFN-γ表達的影響，將T-bet表達質(zhì)粒和miR-27amimics電轉(zhuǎn)EL4細胞，并用適量濃度的PMA和ionomycin刺激，24h后收集樣品并利用Real-TimePCR和ELISA分別檢測IFN-γmRNA和蛋白的表達水平。結(jié)

7、果miR-27a能顯著下調(diào)EL4細胞中IFN-γmRNA和蛋白的表達，說明在T細胞中miR-27a對IFN-γ的表達具有負調(diào)控功能。
　　5.IFN-γ表達與miR-27a表達之間的關系
　　為了更深入的闡明miR-27a在調(diào)控IFN-γ表達中的作用，我們分析了IFN-γ的表達與miR-27a表達之間的關系。加入PMA和ionomycin誘導EL4細胞中IFN-γ表達，并分別于刺激后6h、12h、18h、24h檢測miR-2