CML細(xì)胞的IFN-α反應(yīng)性表面標(biāo)志多肽的作用研究.pdf

1、背景和目的:慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起始于骨髓多能干細(xì)胞惡性增殖性疾病，干擾素α(interferon-α，IFN-α)是治療CML最為有效藥物之一，但I(xiàn)FN-α的耐藥性限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。本課題組前期用噬菌體展示技術(shù)已篩選出能特異性地結(jié)合于對(duì)IFN-α敏感的CML細(xì)胞株KT-1/A3的肽配體:KLWVIPQ，本課題以KLWVIPQ七肽為研究對(duì)象，探索KLWVIPQ對(duì)IF

2、N-α識(shí)別和結(jié)合靶細(xì)胞的影響以及多肽的生物學(xué)效應(yīng)，為CML細(xì)胞對(duì)干擾素的耐藥性機(jī)制提供線(xiàn)索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:本課題利用CML細(xì)胞株KT-1/A3和KT-1/A3R為靶細(xì)胞，構(gòu)建了pEGFP-多肽重組真核表達(dá)載體，同時(shí)化學(xué)合成了熒光標(biāo)記的多肽。重組多肽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)Real Time-PCR檢測(cè)P53 mRNA表達(dá)水平、WST-1試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率、caspase3試劑盒檢測(cè)caspase3酶活性以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞

3、凋亡和周期;化學(xué)合成多肽直接誘導(dǎo)培養(yǎng)KT-1/A3和KT-1/A3R細(xì)胞后通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、WST-1試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率、Western blotting檢測(cè)P53和P210的表達(dá)水平等方法綜合分析多肽KLWVIPQ對(duì)KT-1/A3和KT-1/A3R細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果:Real Time-PCR分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細(xì)胞P53 mRNA表達(dá)增高，與對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與轉(zhuǎn)染重組多肽質(zhì)粒的KT-1/

4、A3細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細(xì)胞中再加入IFN-α后P53的mRNA表達(dá)水平降低。WST-1和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)得出相似的結(jié)果，轉(zhuǎn)染了重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細(xì)胞存活率降低，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的KT-1/A3細(xì)胞中加入IFN-α后細(xì)胞存活率升高。caspase3酶活性檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細(xì)胞caspase3酶活性升高，與對(duì)照組之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但轉(zhuǎn)染重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了p

5、EGFP空質(zhì)粒的KT-1/A3細(xì)胞各加入IFN-α后，兩者之間差異顯著。當(dāng)KT-1/A3細(xì)胞中加入化學(xué)合成多肽0.01μg/mL時(shí)，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)KT-1/A3細(xì)胞存活率降低，與對(duì)照組之間具有顯著性差異，當(dāng)加入多肽后再加入IFN-α，細(xì)胞活性率上升;用WST-1檢測(cè)得出相似的結(jié)果，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IFN-α和多肽都能誘導(dǎo)P53蛋白質(zhì)的表達(dá)，同時(shí)降低P210的表達(dá)量，當(dāng)兩者同時(shí)使用時(shí)多肽和IF