GST pi介導CML細胞的IFN-α抗性研究.pdf

1、慢性髓細胞性白血病(chronic myelognous leukemia，CML)是一種起源于骨髓多能造血干細胞的惡性增殖性疾病，干擾素-α(IFN-α)是治療CML的最有效制劑之一，但是干擾素耐藥比率也很高。本實驗室運用蛋白質(zhì)學方法分別比較分析發(fā)現(xiàn)IFN-α耐藥株KT-1/A3R．細胞高表達GST pi蛋白，然而IFN-α敏感株KT-1/A3細胞幾乎不表達此蛋白，運用半定量RT-PCR和Western blotting也同樣證明上述

2、結(jié)論。先前研究還證明IFN-α誘導A3細胞的細胞凋亡增加顯著，bcr/abl融合基因相應(yīng)表達下調(diào)；而抗性株細胞凋亡不明顯，bcr/abl融合基因表達下調(diào)也不明顯。以上研究表明GSTPl基因可能在A3R細胞對IF-α噸的耐受機制中發(fā)揮著重要的作用。本實驗旨在通過應(yīng)用RNAi，抑制A3R細胞中GSTPl基因的表達，從而增強IFN-α通過bcr/abl融合基因的作用而誘導的KT-1/A3R細胞凋亡，部分逆轉(zhuǎn)A3R細胞對IFN-α的耐藥性。

3、 目的初步探討GSTPl在腫瘤細胞增殖及抵抗細胞凋亡中的作用，為研究IFN-α對CML的耐藥機制提供新的思路。 方法1．選擇目標序列，設(shè)計并合成針對GSTPl基因siRNA模板，構(gòu)建siRNA表達載體pSilencer-GSTP 1-A和pSilencer-GSTP1-B； 2．轉(zhuǎn)染針對GSTPl基因的兩對干擾質(zhì)粒，采用半定量RT-PCR和 Western blotting實驗驗證干擾的效果；3．A3R細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染干擾

4、質(zhì)粒oSilencer-GSTPl-A及在IFN-α誘導下，流式細胞術(shù)檢測48 h及72 h細胞凋亡率，用臺盼藍拒染法計24 h～96 h細胞數(shù)，MTT法測定24h～96 h細胞吸光度值，半定量RT-PCR測定48 h bcr/abl mRNA表達變化，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組與之相比較，并且統(tǒng)計學分析以上結(jié)果。 結(jié)果1．質(zhì)粒與脂質(zhì)體1：4(質(zhì)量/體積)比例混合轉(zhuǎn)染48 h，發(fā)現(xiàn)經(jīng)pSilencer-GSTPl-A干擾后

5、A3R，細胞中GSTPl基因表達下降約78﹪，蛋白表達下降約71﹪，經(jīng)pSilencer-GSTPl-B干擾后A3R細胞GSTPl基因表達下降約53﹪，蛋白表達下降約50﹪；2．經(jīng)oSilencer-GSTPl-A干擾后，與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組相比較，A3R細胞凋亡率48 h增加約4.53﹪，72 h增加約5.71﹪；臺盼藍拒染法：A3R細胞生長抑制率24 h～96 h分別約為4.56﹪、5.94﹪、5.83﹪、5.16﹪；MTT法：A3R細

6、胞生長抑制率24 h～96 h分別約為4.48﹪、5.48﹪、6.06﹪、4.62﹪；RT-PCR測定48 h bcr/abl基因表達下調(diào)約26﹪。結(jié)論1．成功構(gòu)建了兩干擾質(zhì)粒pSilencer-GSTPl-A和pSilencer-GSTPl-B，而且質(zhì)粒干擾效果前者強于后者；2．A3R細胞經(jīng)質(zhì)粒pSilencer-GSTPl-A干擾后能顯著增強IFN-α誘導的細胞凋亡(P<0.05)，但只能輕度抑制細胞生長(P>0.05)；3.GST