IFN-γ對幽門螺桿菌和胃黏膜細(xì)胞作用及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobactel-pylori，H.pylori)是胃部感染最常見的病原微生物，全世界的平均感染率在50％左右，高發(fā)地區(qū)集中在東亞，包括我國還有日本和韓國。導(dǎo)致急慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)等。1994年幽門螺桿菌被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)和國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(TheInter

2、national Agency for Research on Cancer，IARC)列為Ⅰ類致癌因子。胃癌在所有的癌癥中排在第四位，但致死率排在第二位，且預(yù)后不良。胃癌發(fā)生與幽門螺桿菌感染密切相關(guān)。幽門螺桿菌感染宿主后引起胃炎過程中，會(huì)使體內(nèi)Th1/Th2平衡偏向于Th1反應(yīng)，導(dǎo)致大量Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中包括IFN-γ(Interferon-gamma)。IFN-γ是Th1反應(yīng)中的關(guān)鍵分子，也是Th1反應(yīng)中產(chǎn)生最多的免疫分子

3、，是免疫活化的標(biāo)志分子。正常情況下的人體組織或血清中不含有IFN-γ，只有在某些特定因素的刺激下才能誘導(dǎo)其產(chǎn)生。來源于臨床標(biāo)本和動(dòng)物模型的證據(jù)顯示幽門螺桿菌感染所致胃炎患者胃黏膜表面有高水平的IFN-γ。體外細(xì)胞試驗(yàn)也顯示幽門螺桿菌或幽門螺桿菌的組分刺激細(xì)胞后，細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，然而，細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的機(jī)制尚未知。對于IFN-γ在幽門螺桿菌感染引起的胃炎中所起的作用和起作用的機(jī)制，有研究者進(jìn)行了研究。雖然Shimizu et al在

4、兒童感染幽門螺桿菌的病例中發(fā)現(xiàn)IFN-γ和炎癥細(xì)胞浸潤沒有關(guān)聯(lián)，但Antonia et al發(fā)現(xiàn)成人感染幽門螺桿菌后具有高水平的IFN-γ且IFN-γ和單核細(xì)胞浸潤有顯著的聯(lián)系。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明IFN-γ在幽門螺桿菌感染過程中可降低細(xì)菌粘附率，對于清除細(xì)菌具有重要的作用，所以IFN-γ起著保護(hù)性作用；但是若長期感染幽門螺桿菌，IFN-γ起著誘導(dǎo)胃炎的作用。單就IFN-γ對幽門螺桿菌所起的作用還未有研究，特別是IFN-γ在幽門螺桿菌感染引起胃

5、癌中起作用及作用的機(jī)制少有研究。胃癌發(fā)生發(fā)展過程中另一個(gè)重要的因素是胃癌細(xì)胞的增殖。有人報(bào)道癌細(xì)胞對IFN-γ不敏感，但大部分研究者持相反的觀點(diǎn)。IFN-γ是一種致炎因子，IFN-γ在引起炎癥的過程中起誘導(dǎo)作用，大部分研究顯示它對癌細(xì)胞的增殖起負(fù)向調(diào)控作用。有報(bào)道稱IFN-γ可以通過直接或間接地方式引起癌細(xì)胞的凋亡，如引起胃癌、腦膠質(zhì)瘤、多發(fā)性骨髓瘤和宮頸癌等細(xì)胞的凋亡。它還可引起細(xì)胞的衰老、導(dǎo)致細(xì)胞周期變化、降低癌細(xì)胞的侵襲能力以及影

6、響一些基因如編碼促分泌劑3Al(Secretoglobin3Al，SCGB3Al)、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、趨化因子CXCL10(IFN-γ inducible protein-10，IP-10)等基因的表達(dá)、影響基因的修飾如信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(signaltransducer and activator oftranscription，STAT1)的磷酸化等。IFN-γ對胃癌細(xì)胞的衰老、細(xì)胞周期變化是否有影響，

7、是否影響基因的表達(dá)，影響哪些基因的表達(dá)還未見報(bào)道。幽門螺桿菌感染胃黏膜細(xì)胞后，幽門螺桿菌、宿主的免疫和胃癌細(xì)胞的增殖是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。有鑒于此，本研究首先探討了幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細(xì)胞系胃癌細(xì)胞引起細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的信號途徑，然后從IFN-γ調(diào)節(jié)幽門螺桿菌的蛋白質(zhì)表達(dá)和對胃粘膜上皮細(xì)胞系胃癌細(xì)胞的影響入手研究IFN-γ在幽門螺桿菌感染引起胃癌中所起作用及其機(jī)制。
　　 ㈠幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃粘膜細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。細(xì)胞

8、因子主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞和分泌細(xì)胞如黏膜細(xì)胞也能產(chǎn)生某些細(xì)胞因子。以前的研究顯示感染幽門螺桿菌的胃黏膜具有大量的IFN-γ，除了免疫細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，我們通過體外細(xì)胞試驗(yàn)從RNA水平和蛋白水平證實(shí)胃癌細(xì)胞感染幽門螺桿菌后亦能產(chǎn)生IFN-γ。我們將幽門螺桿菌感染細(xì)胞后，幽門螺桿菌的主要毒力CagA(cytotoxin-associated gene A)陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，胃癌細(xì)胞亦能產(chǎn)生IFN-γ。Cag

9、A(cytotoxin-associatedgent A)陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，加入MEK/ERK、Src、P38和NF-KB的抑制劑，發(fā)現(xiàn)加入MEK/ERK、P38和NF-K B抑制劑后，IFN-γ的產(chǎn)生受到抑制，說明幽門螺桿菌刺激IFN-γ的產(chǎn)生依賴于這三者參與的信號途徑。這有助于解釋感染幽門螺桿菌的胃黏膜具有大量的IFN-γ。
　　 ㈡IFN-γ影響幽門螺桿菌的蛋白質(zhì)表達(dá)。幽門螺桿菌感染胃部后，受到酸、膽汁、鹽和NO等人

10、體環(huán)境因子的脅迫，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)。除了以上因素，幽門螺桿菌也暴露于人體的免疫環(huán)境中。免疫分子IFN-γ結(jié)合綠膿桿菌并上調(diào)其主要毒力，通過Blast比對，我們推測IFN-γ結(jié)合幽門螺桿菌，IFN-γ是否調(diào)節(jié)幽門螺桿菌的毒力表達(dá)值得探討。我們首先把對數(shù)期的幽門螺桿菌暴露于IFN-γ中，發(fā)現(xiàn)IFN-γ不影響幽門螺桿菌的生長、增殖和形態(tài)變化。但是我們把對數(shù)期的幽門螺桿菌暴露于IFN-γ2h，用間接免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)IFN-γ結(jié)合于幽門螺桿菌的

11、表面。然后我們用雙向凝膠電泳技術(shù)獲得幽門螺桿菌暴露于IFN-γ6h的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以影響該菌的某些蛋白表達(dá)，如參與DNA復(fù)制的蛋白、參與蛋白翻譯和遞呈的蛋白、壓力蛋白等，其中還包括幽門螺桿菌的主要毒力蛋白CagA。
　　 ㈢IFN-γ下調(diào)幽門螺桿菌的主要毒力蛋白CagA。在雙向凝膠電泳結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們又用RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及Western Blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證了IFN-γ可以使幽門螺桿菌的主要

12、毒力CagA下調(diào)。CagA是幽門螺桿菌的主要和重要毒力，它可以增加胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。CagA被細(xì)菌的Ⅵ型分泌系統(tǒng)注入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞的CagA有磷酸化和非磷酸化狀態(tài)，磷酸化和非磷酸化狀態(tài)都對細(xì)胞有損傷的功能，磷酸化CagA能引起細(xì)胞的蜂鳥狀改變。所以我們把暴露于IFN-γ的幽門螺桿菌感染胃癌細(xì)胞，Western Blot鑒定細(xì)胞內(nèi)的磷酸化和非磷酸化狀態(tài)的CagA，并觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌暴露于IFN-γ后再感染細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的磷酸

13、化和非磷酸化狀態(tài)的CagA都下降，細(xì)胞的蜂鳥狀改變的比率也下降。因?yàn)榱姿峄疌agA可以使鼠特異性的發(fā)展成胃腸腫瘤，所以我們的試驗(yàn)體外證明了IFN-γ下調(diào)幽門螺桿菌的主要毒力蛋白CagA，且具有細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，從而降低胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 ㈣IFN-γ對胃黏膜細(xì)胞的影響及作用。胃癌細(xì)胞暴露于免疫分子IFN-γ，作為重要的免疫活化分子，IFN-γ主要通過免疫系統(tǒng)間接起抗癌作用。但是近來研究顯示IFN-γ可以直接對癌細(xì)胞有負(fù)向的調(diào)控作用

14、。IFN-γ能引起胃癌細(xì)胞的凋亡，它是否引起胃癌細(xì)胞其它的變化值得研究。我們首先把胃癌細(xì)胞暴露于IFN-γ中，做了克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IFN-γ降低了細(xì)胞的克隆形成能力。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)對胃癌細(xì)胞的凋亡沒有影響，通過β-gal染色發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞的衰老也沒有影響。所以我們通過基因芯片技術(shù)檢測了胃癌細(xì)胞暴露于IFN-γ的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以引起某些基因的表達(dá)變化，如與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的基因等。最后通過流式細(xì)胞術(shù)我們發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以引