幽門螺桿菌感染對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞DNA損傷修復(fù)機(jī)制的影響.pdf

1、背景與目的:
　　胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一。最新全球癌癥的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明：全球胃癌男、女性新發(fā)病人數(shù)分別占癌癥的第4位和第5位，男、女胃癌病死率分別占癌癥相關(guān)死亡的第3位和第5位。我國(guó)是胃癌發(fā)病大國(guó)，全球每年新發(fā)胃癌半數(shù)以上在中國(guó)。大多數(shù)胃癌病例確診時(shí)已處晚期，治療方法有限、預(yù)后不佳。明確胃癌的發(fā)生機(jī)制，制定有效的胃癌一級(jí)預(yù)防策略迫在眉睫。
　　DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks, DSB

2、s）是一種最嚴(yán)重的DNA損傷形式，其精確修復(fù)依賴于DNA損傷信號(hào)通路的激活傳遞及各種修復(fù)蛋白的協(xié)同發(fā)揮功能。細(xì)胞自噬對(duì)基因組穩(wěn)定亦發(fā)揮重要作用，細(xì)胞自噬的缺陷可通過影響DNA損傷修復(fù)過程中關(guān)鍵蛋白的活性導(dǎo)致DNA修復(fù)異常。DNA損傷修復(fù)機(jī)制的缺陷易引起基因組的不穩(wěn)定，而這種基因組的不穩(wěn)定性毫無疑問對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著十分重要的促進(jìn)作用。
　　目前認(rèn)為，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, Hp）感染是慢性非萎縮性胃

3、炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌這一演變過程的始動(dòng)因素，然而其確切致癌機(jī)制尚不清楚。Hp感染是否可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生DSBs？DNA損傷反應(yīng)信號(hào)通路及細(xì)胞自噬如何變化？Hp感染是否可以通過干擾 DNA的修復(fù)機(jī)制進(jìn)而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，引起細(xì)胞生物學(xué)功能的異常......？本研究將針對(duì)以上問題進(jìn)行探討，為闡明Hp的致癌機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　?。ㄒ唬〩p感染誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞DSBs的體內(nèi)外研

4、究：
　　1.收集慢性非萎縮性胃炎（chronic non-atrophic gastritis, CNAG）、腸上皮化生（intestinal metaplasia, IM）、異型增生（dysplasia, Dys）和胃癌（gastric cancer, GC）組織，通過免疫組化檢測(cè)各病變階段γH2AX（DSBs的檢測(cè)指標(biāo)）的表達(dá)，并分析其與Hp感染的關(guān)系；
　　2.通過建立Hp活菌體外與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞模型，We

5、stern blot檢測(cè)γH2AX的表達(dá)，中性單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DSBs；
　　3.構(gòu)建Hp感染蒙古沙鼠動(dòng)物模型，免疫組化檢測(cè)胃黏膜組織γH2AX的表達(dá)。
　　（二） Hp感染對(duì)DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路及細(xì)胞自噬的影響：
　　1.免疫組化檢測(cè)不同病變階段胃黏膜標(biāo)本 DNA損傷修復(fù)通路、細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，并分析其與Hp感染的關(guān)系；
　　2.檢測(cè)Hp活菌體外與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)后DNA損傷修復(fù)通路、細(xì)胞自噬

6、相關(guān)指標(biāo)的變化；
　　3.利用Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒檢測(cè)Hp活菌作用GES-1細(xì)胞后自噬流的變化；
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hp活菌與GES-1細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞周期變化；
　　5. Hp活菌與Rad51過表達(dá)或敲除的GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)DSBs及相關(guān)指標(biāo)的變化。
　?。ㄈ┘?xì)胞自噬對(duì)Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞DSBs損傷修復(fù)的影響：
　　1. Hp活菌與自噬干預(yù)后GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)DSB

7、s及相關(guān)指標(biāo)、Rad51的表達(dá)和細(xì)胞周期的變化；
　　2.同時(shí)干預(yù)GES-1自噬水平及Rad51表達(dá)水平，觀察自噬對(duì)DNA損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)是否依賴于Rad51的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬〩p感染誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞DSBs的體內(nèi)外研究：
　　我們通過檢測(cè)不同病變階段胃黏膜標(biāo)本中γH2AX的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在胃黏膜癌變過程中發(fā)揮重要作用，且γH2AX表達(dá)與胃癌部位、大體分型、分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移

8、相關(guān)，與胃癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)γH2AX在Hp陽性IM與Dys組織的表達(dá)高于Hp陰性組。通過構(gòu)建Hp活菌體外與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Hp感染可誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞發(fā)生DSBs。進(jìn)一步在蒙古沙鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) Hp感染可誘導(dǎo)蒙古沙鼠胃黏膜上皮細(xì)胞γH2AX的高表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：Hp體內(nèi)外感染均可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生DSBs。
　?。ǘ〩p感染對(duì)DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路及細(xì)胞自噬的影響：
　　我們檢測(cè)了不

9、同胃黏膜病變階段中DNA損傷修復(fù)通路、細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復(fù)通路及細(xì)胞自噬參與胃黏膜的癌變過程，且與胃癌臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，其中Beclin-1、p62和BRCA2表達(dá)與胃癌預(yù)后呈正相關(guān)，而p-ATM（S1981）、Rad51表達(dá)與胃癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
　　進(jìn)一步分析各病變階段Hp陽性亞組與Hp陰性亞組間的差異，發(fā)現(xiàn)：①在CNAG和IM病變階段，Hp陽性亞組中p-ATM（S1981）、p-Chk2（T68）、p

10、-p53（S15）的表達(dá)均高于Hp陰性亞組；②在Dys病變階段，Hp陽性亞組中Rad51的表達(dá)低于Hp陰性亞組。
　　在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)Hp活菌作用GES-1細(xì)胞6h后即可激活DNA損傷反應(yīng)信號(hào)通路以及細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生S期阻滯；但隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，12h后Rad51蛋白表達(dá)和自噬水平均呈下降趨勢(shì)；轉(zhuǎn)染Rad51質(zhì)粒對(duì)Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞DSBs起保護(hù)作用，敲除Rad51則作用相反。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，Hp

11、感染12月亞組蒙古沙鼠胃黏膜組織p62表達(dá)水平高于對(duì)照組；Hp感染18月亞組蒙古沙鼠胃黏膜組織Rad51表達(dá)水平低于對(duì)照組。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路在胃黏膜癌變?cè)缙诎l(fā)揮重要的抗癌屏障作用；Hp感染可激活胃黏膜上皮細(xì)胞DNA損傷信號(hào)通路及細(xì)胞自噬，但隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，Hp感染可下調(diào)自噬水平并導(dǎo)致 DNA同源重組修復(fù)能力下降。
　　（三）細(xì)胞自噬對(duì)Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞DSBs損傷修復(fù)的影響：
　　我

12、們采用兩種自噬激動(dòng)（Rapamycin和饑餓處理）及自噬抑制劑（3-MA和BafA1）對(duì)GES-1細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，后與Hp活菌共培養(yǎng)；發(fā)現(xiàn)上調(diào)自噬可促進(jìn)GES-1細(xì)胞Rad51表達(dá)，減少DSBs發(fā)生，而抑制自噬則下調(diào)GES-1細(xì)胞Rad51表達(dá)，并促進(jìn)DSBs發(fā)生；進(jìn)一步行補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)（即在上調(diào)自噬的同時(shí)敲除Rad51或抑制自噬的同時(shí)過表達(dá) Rad51），發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬對(duì) DSBs的保護(hù)作用依賴于Rad51的表達(dá)。
　　結(jié)論：