序貫調(diào)控165hVEGF165-Ang-1基因表達對兔缺血心肌新生血管成熟及心功能的影響.pdf

1、目的：本實驗研究為深入了解序貫調(diào)控hVEGF165/Ang-1基因表達誘導(dǎo)缺血心肌血管生成的作用和相關(guān)機制，提高基因治療應(yīng)用的安全性、有效性提供了實驗依據(jù)；同時，對進一步完善聯(lián)合基因治療缺血心臟病亦具有重要的理論意義及應(yīng)用價值。
　　 方法：成年日本大耳白兔，于冠狀動脈左室前降支中下1/3交界處結(jié)扎，建立兔心肌梗死動物模型，在此模型的基礎(chǔ)上，以2型重組腺相關(guān)病毒(rAAV2)為載體，將9HRE（低氧反應(yīng)元件）調(diào)控的hVEGF16

2、5（人血管內(nèi)皮生長因子）及Tet-on-Advanced調(diào)控的Ang-1（血管生長素-1）采用心肌直接注射方法轉(zhuǎn)染兔梗死心肌，通過特定時間點體外主動給予強力霉素(Doxcycline， Dox)，觀察兩系統(tǒng)對轉(zhuǎn)染hVEGF165與Ang-1基因的表達調(diào)控作用，檢測序貫調(diào)控hVEGF165與Ang-1基因表達對缺血心肌新生血管成熟及心臟功能的影響。實驗隨機分為8組：A組（雙基因序貫調(diào)控組）：同期轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE- hVEGF165、

3、rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1混合液（混合比例為4：1：4），基因轉(zhuǎn)染6周后靜脈給予DOX誘導(dǎo)Ang-1表達。B組（雙基因非序貫調(diào)控組）：同期轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE-hVEGF165、rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1混合液(混合比例為4：1：4)，術(shù)后立即靜脈給DOX誘導(dǎo)Ang-1表達。C組（hVEGF165組）：單獨轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE-hVEGF165。

4、D組（Ang-1組）：單獨轉(zhuǎn)染rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1（混合比例為1:4），術(shù)后立即靜脈給DOX誘導(dǎo)Ang-1表達。E組（溶劑對照組）：梗死區(qū)域注射等量生理鹽水，不予DOX誘導(dǎo)。F組（載體對照組）同期轉(zhuǎn)染rAAV-TRE-Tight-luciferase、rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-9HRE-LacZ混合液（混合比例為4:1：4），轉(zhuǎn)染后處理同A組。G組（假手術(shù)組）開胸，在左前降

5、支中下1/3交界處穿線但不結(jié)扎，不予DOX誘導(dǎo)。H組（正常對照組）未開胸正常兔。
　　 通過肉眼觀察、心電圖描記、HE染色和Masson三色染色驗證心肌梗死模型建立成功。采用Western blot方法檢測hVEGF165和Ang-1基因的表達。通過血管滲透性和FITC-Lectin灌注方法檢測新生血管的功能。超聲心動圖檢測評估心臟功能。
　　 結(jié)果：
　　 1．兔心肌梗死模型建立及檢測結(jié)果：
　　 采用

6、結(jié)扎左冠狀動脈前降支中下1/3交界處的方法建立了兔心肌梗死模型，肉眼觀察可見結(jié)扎點下方心尖部及部分左室前壁心肌顏色由紅色變?yōu)樽仙?，面積約15mm×15mm，中心缺血區(qū)周邊部出現(xiàn)暗紅色充血帶。心電圖顯示，術(shù)后ST段弓背向上抬高，表明血管結(jié)扎完全，心肌梗死模型建立成功。肉眼觀察梗死區(qū)形成白色瘢痕組織。HE染色結(jié)果顯示，缺血梗死區(qū)的心肌細胞排列不齊，肌細胞數(shù)量減少，心肌細胞溶解后空泡形成，纖維化，梗死區(qū)大量炎性細胞浸潤。Masson三色染色示

7、，正常心肌纖維呈紅色，梗死區(qū)瘢痕膠原纖維呈藍色。
　　 2.Westernblot檢測結(jié)果：
　　 序貫組與溶劑對照組梗死區(qū)心肌組織均可檢測到hVEGF165蛋白表達，梗死形成初期表達即開始增加，6周時表達量達到高峰，此后表達量逐漸下降，12周時接近基礎(chǔ)值。與溶劑對照組相比，序貫組hVEGF165蛋白表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 序貫組與溶劑對照組梗死區(qū)心肌組織均可檢測到Ang-1蛋白

8、表達，在模型建立后0,2,4,6周表達量極低，8,10，12周表達量增加。與溶劑對照組相比，心肌缺血后8,10和12周，序貫組Ang-1蛋白表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3．新生血管滲透性檢測結(jié)果：
　　 12周肉眼觀察可見各結(jié)扎組心臟在梗死邊緣區(qū)及病毒注射部位均有少量藍色染料殘留。序貫組心臟梗死面積較小，有少量經(jīng)血管滲出并殘留于組織內(nèi)的染料。hVEGF165組心臟可見大片染料殘留。溶劑對照有

9、少量染料殘留，與序貫組相比無明顯差別。正常心臟基本無染料殘留。
　　 單位重量心肌組織Evans blue含量（ng/mg）結(jié)果顯示，與非序貫組，hVEGF165組和Ang-1組相比，雙基因序貫組顯著減少，但高于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4．新生血管Lectin灌注檢測結(jié)果：
　　 功能血管數(shù)檢測結(jié)果顯示，與非序貫組、VEGF165組、Ang-1組、溶劑對照組和載體對照組相比，雙

10、基因序貫組明顯增加，但少于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 功能血管/新生毛細血管結(jié)果顯示，與hVEGF165組、Ang-1組、溶劑對照組及載體對照組相比，雙基因序貫組新生血管灌注功能明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 序貫組梗死邊緣區(qū)可見新生血管長入。
　　 新生血管管徑結(jié)果顯示，與非序貫組、hVEGF165組、Ang-1組、溶劑對照組及載體對照組相比，序貫組管徑明顯增

11、粗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 新生血管側(cè)支數(shù)結(jié)果顯示，與非序貫組、Ang-1組、溶劑對照組及載體對照組相比，序貫組側(cè)支顯著增多，但低于hVEGF165組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5．超聲心動圖檢測結(jié)果：
　　 超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，與其它各實驗組相比，序貫組動物心功能明顯改善，左心室收縮末期內(nèi)徑(LVSD)、舒張末期內(nèi)徑(LVDD)明顯減小。與非序貫組、hVEGF165組、An

12、g-1組、溶劑對照組和載體對照組相比，序貫組FS％值明顯提高，但低于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、在動物整體水平，HIF-9HRE和Tet-on-advanced雙基因調(diào)控系統(tǒng)能有效調(diào)控hVEGF165和Ang-1基因的表達。
　　 2、序貫調(diào)控hVEGF165/Ang-1基因表達可有效促進缺血心肌新生血管成熟及灌注功能的改善。
　　 3、序貫調(diào)控hVEGF