柞蠶絲素作為VEGF165-Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒傳遞載體的研究.pdf

1、工程化組織的血管再生問題是組織工程面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。在三維支架內(nèi)復(fù)合促進(jìn)血管再生的生長因子基因是解決這一問題的重要途徑。VEGF(主要是VEGF165)和Ang(主要是Ang-1)是兩種最重要的且僅以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶細(xì)胞的促血管再生生長因子,在新血管的形成中扮演著關(guān)鍵的角色,但它們在體內(nèi)易被代謝、失活,半衰期短。若能采用適當(dāng)?shù)幕騻鬟f載體裝載外源性VEGF和Ang基因,并裝載到三維支架上,生長因子能穩(wěn)定、持續(xù)、高效地轉(zhuǎn)染周圍細(xì)胞并持續(xù)表達(dá)

2、、分泌相關(guān)的生長因子,則能克服在支架內(nèi)直接復(fù)合生長因子半衰期短的缺陷。而在基因傳遞系統(tǒng)中,基因傳遞載體對轉(zhuǎn)染效率起決定性作用。PEI作為非病毒載體的典型代表,具有質(zhì)子海綿效應(yīng),轉(zhuǎn)染效率較高。但PEI所帶正電荷的密度很高,細(xì)胞毒性較大,且不能被生物降解。柞蠶絲素是一種具有良好細(xì)胞相容性、生物活性和可降解性的蛋白質(zhì),且含RGD序列,可以通過受體介導(dǎo)作用特異性粘附細(xì)胞,并可能進(jìn)而被細(xì)胞內(nèi)吞。帶負(fù)電荷的柞蠶絲素可以與帶正電荷的PEI復(fù)合作為pD

3、NA的傳遞載體,共同包被VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒,降低PEI的細(xì)胞毒性,提高轉(zhuǎn)染效率。
　　本文研究柞蠶絲素蛋白和PEI共同作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒(用GFP作為報告基因)的傳遞載體對EA.hy926細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性的影響,尋找最佳的復(fù)合物制備方案,并將ASF/PEI/DNA復(fù)合物裝載到絲素蛋白多孔支架上考察其對EA.hy926細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染效率,以及在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型中

4、對血管形成的促進(jìn)作用。
　　首先,初步探討了ASF/PEI/DNA轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞的效率。用ASF/PEI/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞并進(jìn)行激光共聚焦觀察和流式細(xì)胞儀GFP陽性細(xì)胞比率檢測。結(jié)果表明, ASF/PEI/DNA(60/3/2)組明顯地比 ASF/PEI/DNA(30/3/2)組和ASF/PEI/DNA(90/3/2)組轉(zhuǎn)染效率高,但比ASF/PEI/DNA(120/3/2)組低。
　　然后,研

5、究了ASF/PEI/DNA三者比例對細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞毒性的影響,尋找最佳的復(fù)合物制備方案。結(jié)果表明,當(dāng)PEI/DNA質(zhì)量比為10μg/2μg時,ASF/PEI/DNA復(fù)合物中加大ASF所占的質(zhì)量比對轉(zhuǎn)染效率的影響較小。MTT法檢測PEI/DNA不同質(zhì)量比對EA.hy926細(xì)胞毒性的影響,結(jié)果表明,當(dāng)PEI與DNA的相對質(zhì)量比分別為3/2,5/1,3/1時,隨著絕對質(zhì)量的增加,細(xì)胞存活率下降,細(xì)胞毒性增大。不同濃度ASF溶液以及不同質(zhì)量比的

6、ASF/PEI/DNA對EA.hy926細(xì)胞毒性影響的MTT測試結(jié)果表明,當(dāng)ASF的濃度為5μg/μL時,ASF/PEI/DNA(60/10/2)的細(xì)胞存活率較高。用流式細(xì)胞儀定量檢測GFP陽性細(xì)胞比率結(jié)果表明,當(dāng)ASF/PEI/DNA的質(zhì)量比為60/3/2時,轉(zhuǎn)染效率相對較高。
　　最后,在絲素支架內(nèi)裝載ASF/PEI/DNA(60/10/2)復(fù)合物研究其體外轉(zhuǎn)染效果。用CM-DiL和SEM觀察二維培養(yǎng)細(xì)胞在支架內(nèi)的分布情況;用

7、DAPI染核和CM-DiL活細(xì)胞染色劑觀察三維培養(yǎng)細(xì)胞在支架中的粘附生長情況。結(jié)果顯示,二維培養(yǎng)條件下,在材料的內(nèi)部和表面均可觀察到大量的細(xì)胞,且細(xì)胞在支架中能比較充分地鋪展;三維培養(yǎng)細(xì)胞至3d時細(xì)胞數(shù)量比1d時少了,但在隨后7、9和14d時細(xì)胞數(shù)量呈明顯的增多趨勢。將包裹含GFP報告基因的質(zhì)粒DNA的復(fù)合物裝載到支架上轉(zhuǎn)染細(xì)胞,結(jié)果在支架中可以觀察到發(fā)熒光的細(xì)胞。ASF/PEI/DNA(60/10/2)復(fù)合物對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)

8、的血管生成的促進(jìn)作用的結(jié)果表明,裝載VEGF165-Ang-1雙基因的絲素蛋白多孔支架比裝載VEGF165或Ang-1單基因的多孔支架生成的血管更豐富,呈彌漫、放射狀血管形成。說明用ASF與PEI聯(lián)合包被VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)載體質(zhì)粒,不僅細(xì)胞毒性較低,且VEGF165-Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以正常地表達(dá)、分泌相應(yīng)的生長因子,從而促進(jìn)血管形成。
　　本文不僅較系統(tǒng)地研究了ASF/PEI/DNA復(fù)合物