聯(lián)合調(diào)控tPA和VEGF165基因防治移植心臟血管狹窄研究.pdf

1、本論文共分五部分，內(nèi)容如下： 第一部分，目的：克隆人組織纖溶酶原激活物(tPA)基因并構(gòu)建攜帶tPA基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/tPA，并研究其有無(wú)生物學(xué)活性。 方法：用RT-PCR法從人心臟組織中克隆tPA基因并將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，對(duì)pcDNA3.1(+)/tPA進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1(+)/tPA轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)，分別用NothernBlo

2、t和斑點(diǎn)印跡法從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)tPA的表達(dá)，并用纖維蛋白板法測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。 結(jié)果：成功地克隆了人tPA基因并構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/tPA真核表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果顯示克隆的全長(zhǎng)t-PA基因片段與基因文庫(kù)報(bào)告一致；pcDNA3.1(+)/tPA轉(zhuǎn)染VSMC后，tPAmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加，所表達(dá)的tPA蛋白質(zhì)具有纖溶活性。 結(jié)論：含t-PA基因新型真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，讓其轉(zhuǎn)染VSMC后其表達(dá)蛋

3、白質(zhì)具有纖溶活性，為利用基因防治移植心臟血管狹窄底實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分，目的：構(gòu)建人VEGF165基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1/VEGF165，觀察其在血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)中的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物對(duì)VEC增殖的影響。 方法：用RT-PCR法從引產(chǎn)胎兒心臟組織中克隆VEGF165基因，并將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1中，對(duì)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1/VEGF165進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。以脂質(zhì)體

4、轉(zhuǎn)染法將pBudCE4.1/VEGF165導(dǎo)入VEC中，Northernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)它們?cè)谵D(zhuǎn)染的VEC中的表達(dá)，并檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)VEC增殖的影響。 結(jié)果：人VEGF165基因的RT-PCR產(chǎn)物為576bp。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增的VEGF165基因的序列與基因文庫(kù)中登錄的序列完全一致。經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ酶切鑒定證實(shí)，VEGF165基因已成功地克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1

5、中。以其轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)后，經(jīng)Northernblot雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)均證實(shí)VEGF165基因表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物對(duì)VEC增殖有明顯的促進(jìn)作用。 結(jié)論：所構(gòu)建的pBudCE4.1/VEGF165真核表達(dá)質(zhì)?？稍赩EC中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可明顯促進(jìn)VEC增殖，為通過(guò)VEGF165基因轉(zhuǎn)染防治移植器官內(nèi)血管的狹窄奠定了基礎(chǔ)。 第三部分，目的：構(gòu)建攜帶人組織纖溶酶原激活物(tPA)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEG

6、F165)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165，并觀察其在內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)中的表達(dá)。 方法：將tPA和VEGF165基因克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1中，構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165。將pBudCE4.1/tPA-VEGF165轉(zhuǎn)染VEC，用RT-PCR法和Westernblot法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)被轉(zhuǎn)染的VEC中的tPA和VEGF165表達(dá)。

7、結(jié)果：人tPA和VEGF165基因的RT-PCR產(chǎn)物分別為1.9kb和576bp。經(jīng)酶切鑒定證實(shí)，tPA和VEGF165基因已克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1中。以其轉(zhuǎn)染VEC后，經(jīng)RT-PCR法和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，tPA和VEGF165在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)。 結(jié)論：成功地構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165，并在VEC中表達(dá)tPA和VEGF165，為tPA和VEGF165基因

8、轉(zhuǎn)染防治移植器官內(nèi)血管狹窄奠定了基礎(chǔ)。 第四部分，目的：觀察組織纖溶酶原激活物(tPA)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子165(VEGF165)基因共表達(dá)質(zhì)粒在血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中的表達(dá)，并研究表達(dá)產(chǎn)物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)和VSMC增殖的影響和纖溶作用。 方法：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將tPA和VEGF165的共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165導(dǎo)入VSMC中，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附

9、實(shí)驗(yàn)(ELISA)分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)tPA和VEGF165的表達(dá)；纖溶蛋白板法檢測(cè)轉(zhuǎn)染基因的VSMC培養(yǎng)基中tPA的纖溶活性；取轉(zhuǎn)染pBudCE4.1/tPA-VEGF165的VSMC培養(yǎng)基培養(yǎng)VEC和VSMC，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因VSMC的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)VEC和VSMC增殖的影響。 結(jié)果：pBudCE4.1/tPA-VEGF165轉(zhuǎn)染VSMC后，RT-PCR和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，tP

10、A和VEGF165在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)；轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)基有明顯促進(jìn)纖溶和促VEC增殖作用，而對(duì)VSMC增殖無(wú)作用。 結(jié)論：tPA和VEGF165基因共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表達(dá)有生物學(xué)活性的tPA和VEGF165，為tPA和VEGF165基因轉(zhuǎn)染防治移植心臟內(nèi)血管狹窄奠定了基礎(chǔ)。 第五部分，目的：觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染組織纖溶酶原激活物(tPA)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VEGF165

11、)基因?qū)π∈笠浦残呐K內(nèi)血管狹窄的影響并探討可能機(jī)制。 方法：C57BL/6小鼠作為移植供體，Balb/c小鼠作為移植受體，利用顯微外科技術(shù)建立小鼠心臟移植模型。用微注射方法，將攜帶有tPA和VEGF165基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165灌注小鼠移植心臟血管。實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組：A組(生理鹽水轉(zhuǎn)染組)；B組(空載質(zhì)粒pBudCE4.1轉(zhuǎn)染組)；C組(攜帶有tPA和VEGF165基因的pBudCE4.1/tP

12、A-VEGF165轉(zhuǎn)染組)。按實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(術(shù)后1d、3d、7w、14d和28d)分為5個(gè)亞組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)取移植心臟用于病理學(xué)檢測(cè)、電鏡觀察、RT-PCR和Western印跡檢查。 結(jié)果：術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)基因轉(zhuǎn)染組移植心臟tPA和VEGF165基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。與對(duì)照組比較，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)基因轉(zhuǎn)染組移植心臟血管內(nèi)膜面積和狹窄率均顯著減小(P＜0.01)，術(shù)后28d時(shí)基因轉(zhuǎn)染組管腔狹窄率比對(duì)照組降