tPA-VEGF165雙基因靜電紡絲涂層機械瓣膜的構(gòu)建及體外實驗研究.pdf

1、第一部分：tPA-VEGF165真核表達載體的構(gòu)建
　　 目的：通過克隆從模板中獲得人組織型纖溶酶原激活因子（tPA）和人血管內(nèi)皮細胞生長因子165（VEGF165）目的基因片段，然后將其分別插入真核表達載體pIRES 質(zhì)粒的兩個多克隆位點，以構(gòu)建攜帶目的基因的兩個載體質(zhì)粒pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165。
　　 材料和方法：按照人tPA基因的CDS 序列（NM_000930.3）和

2、人VEGF165基因的序列（NM_001025368）設(shè)計引物，引物分別包含內(nèi)切酶EcoR I和Xba I 酶切位點，以pcDNA3.1-Myc-His B(-)／tPA 質(zhì)粒和cDNA文庫為模板，PCR擴增獲得目的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收DNA；分別用內(nèi)切酶EcoR I和Xba I將pIRES 質(zhì)粒線性化，然后把tPA和VEGF165目的基因片段重組入多克隆位點，并調(diào)換插入順序，分別獲得pIRES-VEGF165-tPA

3、和pIRES-tPA-VEGF165兩個質(zhì)粒；所構(gòu)建的表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，篩選單克隆，菌落PCR檢測目的基因，然后將陽性重組質(zhì)粒送檢測序。
　　 結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明PCR擴增目的基因，獲得大小約為1721bp和1151bp的DNA，與人tPA和VEGF165基因序列相符合；菌落PCR表明pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞均可得到陽性轉(zhuǎn)化子，而他們

4、的測序結(jié)果表明載體質(zhì)粒中所包含的基因序列與Pubmed中其對應的CDS 序列相比，插入方向正確，tPA基因中的CTG（編碼Leu）同義突變?yōu)镃TA（編碼Leu），VEGF165基因中同樣也僅出現(xiàn)數(shù)個同義突變，均不會影響蛋白表達。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建出了攜帶人組織型纖溶酶原激活因子（tPA）和人血管內(nèi)皮細胞生長因子165（VEGF165）目的基因片段的兩個載體質(zhì)粒pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF1

5、65。
　　 第二部分：tPA-VEGF165真核表達載體的體外轉(zhuǎn)染實驗
　　 目的：通過體外轉(zhuǎn)染實驗，檢測所構(gòu)建的真核表達載體pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒能否轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，并檢測目的基因在轉(zhuǎn)錄，翻譯，以及蛋白分泌和功能方面的情況，同時比較pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染和蛋白表達方面有無區(qū)別。
　　 材料和方法：轉(zhuǎn)染試

6、劑Attractene Transfection Reagent 介導pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒體外瞬時轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞（EA.hy926），同時，以表達綠色熒光蛋白的pGFP 質(zhì)粒與載體質(zhì)粒按照1：1的比例共轉(zhuǎn)染EA.hy926細胞，以綠色熒光蛋白作為示蹤標志，計算轉(zhuǎn)染后12h，24h和48h 瞬時轉(zhuǎn)染效率，設(shè)置轉(zhuǎn)染空pIRES 質(zhì)粒和空白PBS 作為對照；
　　 熒光實時定

7、量RT-PCR檢測各組細胞中tPA和VEGF165的mRNA 相對含量，Western blot 檢測細胞中的蛋白表達情況；提取轉(zhuǎn)染后細胞上清，ELISA 檢測上清液中所含有的分泌蛋白tPA和VEGF165濃度，并用MTT 試驗和tPA 活性檢測試劑盒評價蛋白功能。
　　 結(jié)果：通過計算轉(zhuǎn)染后綠色熒光下陽性細胞的比率發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后約24h，陽性細胞比率最高，隨后逐漸減少，pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VE

8、GF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率分別約為15.6±3.1％和16.3±2.9％，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義；熒光實時定量RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒組細胞中VEGF165和tPA的mRNA相對含量及蛋白含量明顯高于轉(zhuǎn)染pIRES 空質(zhì)粒和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義，轉(zhuǎn)染pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒組細胞中tPA基因的mRNA 相對含量和蛋白含

9、量高于轉(zhuǎn)染pIRES-VEGF165-tPA組，差異有統(tǒng)計學意義；而VEGF165基因方面兩組間差異無統(tǒng)計學意義；ELISA，MTT 試驗以及tPA 蛋白活性檢測結(jié)果提示轉(zhuǎn)染pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒組細胞上清中VEGF165和tPA的蛋白含量及功能明顯高于轉(zhuǎn)染pIRES 空質(zhì)粒和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義，而轉(zhuǎn)染pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒

10、組間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：所構(gòu)建的pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒能夠在體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，并指導合成、分泌有功能活性的tPA和VEGF165蛋白，盡管轉(zhuǎn)染pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒組細胞內(nèi)目的基因的mRNA和蛋白含量略高，但不能因此認定它與pIRES-VEGF165-tPA 質(zhì)粒在功能上存在差異。
　　 第三部分：交聯(lián)明膠微球靜電紡絲涂層滌綸材料的制備及相關(guān)

11、理化性質(zhì)的研究
　　 目的：以交聯(lián)明膠微球作為緩釋載體，通過靜電紡絲技術(shù)將其與滌綸材料有機結(jié)合，制備出能夠長期釋放質(zhì)粒DNA的復合材料，并檢測該材料在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、細胞相容性、載藥率等理化性質(zhì)方面的特點，以期將該材料用于構(gòu)建新型機械瓣膜。
　　 材料和方法：將交聯(lián)明膠微球和10％聚乙烯醇（PVA）溶液按照不同的質(zhì)量容積比配制成電紡液，設(shè)置電壓，噴頭距離等參數(shù)進行紡絲，滌綸補片置于接收裝置內(nèi)接受紡絲纖維，最終制得超細纖維涂層

12、的復合滌綸材料，掃描電鏡檢測表面形態(tài)；將涂層滌綸材料小塊置入蒸餾水中，與搖床上振搖檢測材料成分的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；MTT 試驗檢測涂層滌綸材料對EA.hy926細胞增殖的影響；按照質(zhì)粒/涂層滌綸材料不同質(zhì)量比將兩者混合，通過測量結(jié)合后溶液中剩余質(zhì)粒的量來計算涂層滌綸材料載藥率，同時也測量單純滌綸材料以及單純的紡絲涂層材料的載藥率作為對比；最后將結(jié)合有質(zhì)粒的涂層滌綸材料置PBS 溶液中，37℃下以30rpm的速度持續(xù)振搖，間斷提取溶液樣本，以在

13、260nm 處的吸光度值作為相對含量，繪制材料緩釋質(zhì)粒的曲線。
　　 結(jié)果：交聯(lián)明膠微球和PVA 溶液的質(zhì)量容積比在1/100 之內(nèi)時，室溫下，電壓16-20kV，接收距離10-12cm，注射速度2-4ml/h 電紡可以獲得均一的超細纖維氈，交聯(lián)明膠微球散布與纖維之間，并隨著微球質(zhì)量的增加，分布密度也增加；在30-200rpm的速度振搖下涂層滌綸材料各部分結(jié)合緊密，結(jié)構(gòu)完整未見明顯脫落現(xiàn)象；MTT 試驗證實涂層滌綸補片干預組細胞

14、與單純Dacron 補片干預組細胞，以及空白對照組細胞間增殖速度相當，差異無統(tǒng)計學意義；當質(zhì)粒與涂層滌綸材料質(zhì)量比在1：100 左右時，材料的載藥率達到最大值75％左右，隨后進一步加大投入的質(zhì)粒量，并不能增加載藥率；根據(jù)緩釋曲線可見涂層滌綸材料可以在體外逐漸釋放質(zhì)粒，前2天釋放速度較快，從第8天開始減慢，第12天以后釋放的總的質(zhì)粒的量呈減少趨勢。
　　 結(jié)論：攜帶質(zhì)粒的交聯(lián)明膠微球可以通過靜電紡絲技術(shù)同滌綸材料進行結(jié)合，該復合材

15、料在流體剪切力的作用下可以保持結(jié)構(gòu)完整，它的相容性好對細胞增殖無明顯影響，能夠攜帶質(zhì)粒DNA并且在體外逐步釋放，可以用于構(gòu)建新型機械瓣膜。
　　 第四部分：tPA-VEGF165雙基因交聯(lián)明膠微球靜電紡絲涂層滌綸材料的體外轉(zhuǎn)染實驗
　　 目的：通過體外實驗，檢測攜帶質(zhì)粒的交聯(lián)明膠微球靜電紡絲涂層滌綸材料對細胞的轉(zhuǎn)染效率以及是否能夠分泌相關(guān)目的蛋白。
　　 材料和方法：將攜帶質(zhì)量比為1：1的pIRES-tPA-VE

16、GF165質(zhì)粒和pGFP 質(zhì)粒的涂層滌綸材料浸入完全細胞培養(yǎng)基中，獲取其在不同時段的浸提液，然后加入微泡造影劑Sono Vue 輔以頻率1MHz，強度2 W/cm2的超聲照射60sec，介導對EA.hy926細胞的瞬時轉(zhuǎn)染，24h后通過計數(shù)綠色熒光的陽性細胞計算轉(zhuǎn)染效率；超聲微泡介導pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染EA.hy926細胞，并設(shè)置轉(zhuǎn)染空pIRES 質(zhì)粒和空白PBS 作為對照，24h后ELISA 檢測細胞上清中t

17、PA和VEGF165蛋白含量。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染pIRES-tPA-VEGF165/pGFP 質(zhì)粒組細胞在6天內(nèi)均有陽性細胞，其中前兩天轉(zhuǎn)染效率較高，約20％，隨后有所下降，對照組無陽性細胞出現(xiàn)；ELISA 結(jié)果提示轉(zhuǎn)染了pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒的各組細胞上清每個時段均能檢出tPA和VEGF165蛋白，整體趨勢與細胞轉(zhuǎn)染效率相似，而且其相對含量明顯高于同時段的對照組，差異有統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)染pIRES 空質(zhì)粒和空白P