HIF-1α突變體對缺血心肌血管生成及心功能影響的研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是近年來發(fā)達(dá)國家主要的死亡原因之一，在發(fā)展中國家的發(fā)病率和死亡率也呈現(xiàn)明顯升高趨勢?？鼓⒖寡“寰奂?、調(diào)脂、穩(wěn)定斑塊是近年來針對缺血性心臟病的常規(guī)藥物治療措施，經(jīng)皮介入血管重建術(shù)發(fā)展迅速和冠狀動脈旁路移植術(shù)也是近年來的重要治療手段，但同時都存在支架內(nèi)及移植血管再狹窄、部分患者因病變彌漫不適合介入治療的等問題，影響患者預(yù)后。
　　在因血管狹窄或阻塞等病變導(dǎo)致組織器官缺血時,機(jī)體內(nèi)

2、相關(guān)促血管新生因子被激發(fā)而表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)缺血局部側(cè)支循環(huán)的形成，但自身的這種代償作用往往不完全或不及時。治療性血管生成，通過外源性補(bǔ)充促血管生成因子（重組蛋白或基因）直接促進(jìn)新生血管的生成，從而改善缺血組織的血液供應(yīng)。近年來在缺血性實驗動物的研究中所開展的治療性血管新生主要是基因治療和蛋白質(zhì)治療，二者對比，蛋白質(zhì)治療所需劑量大，效用維持時間短，一般需要反復(fù)使用，目前已很少被應(yīng)用?；蛑委熆稍诰植砍掷m(xù)表達(dá)起作用，有可能僅需單次治療就能達(dá)到

3、預(yù)期的治療效果。故而以基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來促進(jìn)血管新生成為目前的研究重點(diǎn)。
　　隨著對血管生成機(jī)制的逐步研究,近年來發(fā)現(xiàn)了許多有促進(jìn)血管生成能力的因子。最早被用于動物與臨床研究的為VEGF（Vascular endothelial growth factor）與FGF（Fibroblast growth factor）。VEGF和FGF通過了I期臨床試驗，但I(xiàn)I期臨床試驗的結(jié)果卻不容樂觀[1]，發(fā)現(xiàn)VEGF可引起不成熟血管的生成、血管滲

4、透性變大、組織水腫出現(xiàn)[2]，F(xiàn)GF在促進(jìn)新生血管形成的同時,部分實驗患者出現(xiàn)了明顯的蛋白尿。故而需要尋找新的促血管生成因子。
　　血管新生是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，需要多種因子共同參與，依靠單一的促血管新生因子很難順利完成。近年研究顯示：HIF-1是一個非常重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能直接或間接調(diào)控100多種下游靶基因[3，4]，這些下游靶基因在血管生長、血管張力、紅細(xì)胞生成、糖代謝、干細(xì)胞誘導(dǎo)分化等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[5]。HIF-1是由

5、α和β兩個亞基組成的異二聚體[6]，以異源性二聚體的結(jié)構(gòu)形式存在。HIF-1α是專一受O2調(diào)節(jié)的HIF-1亞單位，決定HIF-1的活性。在血管生成基因治療領(lǐng)域，研究的重點(diǎn)是HIF-1α。到目前為止，已查明經(jīng) HIF-1α直接調(diào)控參與血管新生的基因有30多種，是血管新生的上游核心調(diào)控因子[7-10]。
　　HIF-1α結(jié)構(gòu)域中含有氧依賴降解區(qū)(Oxygen Dependent Degradation Domain, ODDD)，OD

6、DD區(qū)Pro402以及Pro564的兩個脯氨酸殘基是否羥基化決定其蛋白穩(wěn)定性[11]。HIF-1αC末端含有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(C-Transactivation Domains,C-TAD)。C-TAD的Asn803是否被羥基化決定其蛋白轉(zhuǎn)錄活性[12]。常氧情況下，Pro402、Pro564和Asn803被羥化后，HIF-1α不穩(wěn)定，在3-5分鐘內(nèi)被迅速降解，轉(zhuǎn)錄活性下降。低氧時，該過程受到抑制[13，14]。
　　因此對ODD

7、D區(qū)的402，564位點(diǎn)和TAD區(qū)的803位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合突變，理論上可以最大程度地提高HIF-1α的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，從而達(dá)到滿意的促血管生成作用的效果。我們的前期離體研究表明將HIF-1α關(guān)鍵功能區(qū)ODDD的Pro402、Pro564兩個位點(diǎn)及TAD的Asn803聯(lián)合突變構(gòu)建的Ad-HIF-1α-Trip在常氧下能穩(wěn)定存在，從而進(jìn)一步促進(jìn)對下游促血管生成因子的調(diào)控。
　　本研究建立大鼠急性心肌梗死模型，采用肌肉注射的方式將以腺病毒

8、為載體的HIF-1α突變體Ad-HIF-1α-Trip轉(zhuǎn)染于大鼠缺血心肌局部，研究Ad-HIF-1α-Trip對大鼠缺血心肌的促血管生成作用及部分安全性。
　　研究方法：
　　1.構(gòu)建Ad-HIF-1α-402/564、Ad-HIF-1α-Trip，Ad-HIF-1α-402/564、Ad-HIF-1α-Trip在 HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，氯化銫密度梯度離心、透析純化后滴度達(dá)到1.0×1011PFU/ml(本課題組先期構(gòu)建)

9、。
　　2.建立急性大鼠心肌梗死模型150只,隨機(jī)分成5組:Saline組、Ad-Null組、Ad-HIF-1α-402/564組、Ad-HIF-1α-Trip組、VEGF組，在缺血心肌通過肌肉注射方式進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染?；蜣D(zhuǎn)染后7天、14天、21天，28天對大鼠行心臟彩超檢查評價心功能，取大鼠心臟行病理切片、免疫組化CD31染色，觀察血管新生情況;基因轉(zhuǎn)染后28天處死大鼠，取心臟，行TTC染色檢查，評估梗死面積。
　　3.基因

10、轉(zhuǎn)染后1周抽取靜脈血測定心肌酶、肌鈣蛋白I、肝功能、腎功能、血常規(guī)。
　　4.應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.超聲結(jié)果顯示:基因轉(zhuǎn)染后7天，LVEF、LVFS均表現(xiàn)為Ad-HIF-1α-Trip組＞VEGF/Ad-HIF-1α-402/564＞Saline組/Ad-Null組，隨時間延長，各組指標(biāo)均呈現(xiàn)隨時間而下降的趨勢，但Ad-HIF-1α-Trip組相對穩(wěn)定，提示Ad-HIF-1

11、α-Trip對心功能有保護(hù)作用，其它各組心功能均有不同程度的降低。
　　2.基因轉(zhuǎn)染后7天轉(zhuǎn)染部位心肌組織免疫組化可見，CD31陽性細(xì)胞被染成棕黃色或棕色，散布于心肌梗死區(qū)及心肌梗死周邊區(qū)，Ad-HIF-1α-Trip組表現(xiàn)最為明顯。進(jìn)行微血管密度計數(shù)（Microvessel density, MVD）計數(shù)，由高到低依次為：Ad-HIF-1α-Trip＞VEGF組/Ad-HIF-1α-402/564＞Ad-Null組＞Saline

12、組，One way ANOVA分析結(jié)果顯示：組間對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩對比結(jié)果顯Ad-Null組與Saline組間，VEGF組與Ad-HIF-1α-402/564組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），余兩兩對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P＜0.05）?；蜣D(zhuǎn)染后14天，Ad-HIF-1α-Trip組、VEGF組、Ad-HIF-1α-402/564組MVD明顯減少，但仍多于Ad-Null組及Saline組，至基因轉(zhuǎn)染后28

13、天，5組MVD大致在同一水平。
　　3.大鼠急性心肌梗死模型基因轉(zhuǎn)染后7天，大鼠血常規(guī)和生化指標(biāo)比較結(jié)果顯示：各組大鼠白細(xì)胞計數(shù)均表現(xiàn)為略有增高，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），RBC、RBC、PLT、Hb、MCV、MCH計數(shù)均在正常范圍，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），cTnI、CK、CK-MB濃度均高于正常值，由低至高均表現(xiàn)為Ad-HIF-1α-Trip組＜VEGF組/Ad-HIF-1α-402/564組＜Ad-

14、Null組/Saline組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肝腎功能指標(biāo)未見明顯異常。
　　4.HE染色結(jié)果顯示：術(shù)后不同時間點(diǎn)，心、肝、腎、肺、脾、睪丸HE染色光鏡下觀察未見明顯病理組織學(xué)改變。
　　5.TTC染色結(jié)果示：術(shù)后28天，用TTC染色方法檢測各組大鼠心肌梗死面積。Ad-Null組/Saline組＞VEGF組/Ad-HIF-1α-402/564組＞Ad-HIF-1α-Trip組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研