蛻皮激素和保幼激素對(duì)誘導(dǎo)家蠶絲蛋白基因表達(dá)作用的研究.pdf

1、蛻皮激素（Ecdysone，20-hydroxyecdysone，20E）和保幼激素（Juvenile hormone，JH）協(xié)同調(diào)控昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育。其中，昆蟲絲物質(zhì)合成和分泌的過(guò)程也受到激素的調(diào)控。蛻皮激素通過(guò)由蛻皮激素受體（Ecdysone receptor，EcR）和超氣門蛋白（Ultraspiracle，USP）組成的異源二聚體發(fā)揮作用。保幼激素（Juvenile hormone，JH）能特定結(jié)合到USP蛋白，引起受體分子構(gòu)象改

2、變，起到促進(jìn)二聚化穩(wěn)定受體二聚體的作用。
　　家蠶是重要的產(chǎn)生絲物質(zhì)的經(jīng)濟(jì)昆蟲，但蛻皮激素和保幼激素協(xié)同調(diào)控家蠶絲蛋白基因表達(dá)的機(jī)制還不清楚。為了研究20E和JH對(duì)家蠶絲蛋白基因的表達(dá)調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)了激素處理后中部絲腺Ser-1基因及后部絲腺Fib-H、Fib-L和P25基因的表達(dá)水平；為了識(shí)別出絲蛋白基因啟動(dòng)子上的蛻皮激素響應(yīng)元件（Ecdysone response element，EcRE），通過(guò)等

3、溫量熱滴定（Isothermal titration calorimetry，ITC）技術(shù)分別檢測(cè)了純化后的蛻皮激素受體和超氣門蛋白（EcR-B1D/USPD）結(jié)構(gòu)域蛋白復(fù)合體與預(yù)測(cè)的家蠶絲蛋白基因EcREs的相互作用,還對(duì)20E-EcR-B1D/USPD-EcRE調(diào)控模型做了進(jìn)一步地分析。結(jié)果如下：
　　1.體外條件下中部絲腺經(jīng)激素處理后Ser-1基因的表達(dá)特征分析
　　為了研究激素處理后Ser-1基因在中部絲腺的表達(dá)特征

4、，本研究體外培養(yǎng)了家蠶五齡幼蟲中部絲腺，在培養(yǎng)基中加以不同激素處理。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的20E或JH處理后，Ser-1的表達(dá)均受到抑制；然而，20E和JH共同處理后，Ser-1的表達(dá)在72 h明顯上調(diào)，這表明，20E和JH共同作用更有利于提高絲蛋白基因的表達(dá)。
　　2.體外條件下后部絲腺經(jīng)激素處理后Fib-H、Fib-L和P25基因的表達(dá)特征分析
　　2.1激素對(duì)Fib-H基因表達(dá)的影響
　　為了研究激素處理后Fib-

5、H的表達(dá)變化，本研究體外培養(yǎng)了家蠶五齡幼蟲后部絲腺，在培養(yǎng)基中加以不同激素處理。結(jié)果表明，不同濃度的20E或JH處理后，F(xiàn)ib-H的表達(dá)均受到抑制。20E和JH共同處理后，F(xiàn)ib-H的表達(dá)均在72 h顯著提高。以20E處理24 h后轉(zhuǎn)入含有20E和JH的培養(yǎng)基共同處理，或者以JH處理24 h后轉(zhuǎn)入含有20E和JH的培養(yǎng)基共同處理，這兩種處理對(duì)Fib-H表達(dá)的影響沒(méi)有明顯差異。
　　2.2激素對(duì)Fib-L基因表達(dá)的影響
　　為

6、了研究激素處理后Fib-L的表達(dá)變化，本研究體外培養(yǎng)了家蠶五齡幼蟲后部絲腺，在培養(yǎng)基中加以不同激素處理。結(jié)果表明，0.1μg/mL20E對(duì)Fib-L的表達(dá)沒(méi)有明顯影響，0.5μg/mL和2.5μg/mL濃度的20E不同程度的促進(jìn)了Fib-L的表達(dá)；不同濃度的JH對(duì)Fib-L的表達(dá)均有抑制作用。
　　另外，研究發(fā)現(xiàn)，0.5μg/mL20E和0.5 ng/mL JH共同處理對(duì)Fib-L的表達(dá)存在抑制作用，0.5μg/mL20E和5 n

7、g/mL JH處理組及0.1μg/mL20E和5 ng/mL JH處理組促進(jìn)了Fib-L的表達(dá)，并且后者的促進(jìn)效果更明顯，這表明20E和JH對(duì)Fib-L的調(diào)控有濃度依賴性；以20E處理24 h后轉(zhuǎn)入含有20E和JH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)促進(jìn)了Fib-L的表達(dá)，然而以JH處理24 h后轉(zhuǎn)入含有20E和JH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)抑制了Fib-L的表達(dá)，這表明激素處理的先后對(duì)Fib-L的表達(dá)存在顯著影響。
　　2.3激素對(duì)P25表達(dá)的影響
　　為

8、了研究激素處理后P25的表達(dá)變化，本研究體外培養(yǎng)了家蠶五齡幼蟲后部絲腺，在培養(yǎng)基中加以不同激素處理。結(jié)果表明，不同濃度的20E對(duì)P25的表達(dá)有促進(jìn)作用，不同濃度的JH對(duì)P25基因的表達(dá)有抑制作用。
　　另外，研究發(fā)現(xiàn)，0.5μg/mL20E和0.5 ng/mL JH共同處理對(duì)P25的表達(dá)有抑制作用，而0.5μg/mL20E和5 ng/mL JH處理組及0.1μg/mL20E和5 ng/mL JH處理組促進(jìn)了P25的表達(dá)，并且后者的

9、促進(jìn)效果更明顯，這表明20E和JH對(duì)P25的調(diào)控有濃度依賴性；在以20E處理24 h后轉(zhuǎn)入含有20E和JH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)或者以JH處理24 h后轉(zhuǎn)入含有20E和JH的培養(yǎng)基中對(duì)P25的表達(dá)沒(méi)有明顯差別，這表明激素處理先后對(duì)P25表達(dá)的影響沒(méi)有明顯差別。
　　3.蛻皮激素受體結(jié)構(gòu)域EcR-B1D和超氣門蛋白結(jié)構(gòu)域USPD的共表達(dá)
　　本研究克隆USPD基因片段并連接到pET-28a載體上，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，

10、然后用EcR-pET21b-MDX12重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有USP-pET-28a(+)的E.coli BL21(DE3)感受態(tài)。IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，利用SDS-PAGE和Western blot鑒定表達(dá)結(jié)果。使用Ni-NTA親和層析柱純化，得到了EcR-B1D/USPD蛋白復(fù)合物，純度達(dá)到95％。4. EcR-B1D/USPD與絲蛋白基因蛻皮激素響應(yīng)元件（EcREs）的結(jié)合反應(yīng)
　　在體外條件下通過(guò)ITC獲得了EcR-B1D/U

11、SPD蛋白與預(yù)測(cè)的家蠶絲蛋白基因EcREs相互作用的一系列熱力學(xué)參數(shù)包括親和力常數(shù)（K）、反應(yīng)熱（ΔH）和熵（ΔS）。EcR-B1D/USPD蛋白能夠與預(yù)測(cè)的絲蛋白基因的EcREs進(jìn)行結(jié)合，結(jié)果表明，預(yù)測(cè)的序列TTTTC、TCTTT、ACTTT、TTTTC可能分別是Fib-H、Fib-L、P25、Ser-1基因EcRE的關(guān)鍵序列，并且該序列是保守的。
　　5.20E與EcR-B1D/USPD復(fù)合體及EcRE的模型分析
　　在

12、體外條件下通過(guò) ITC研究發(fā)現(xiàn)，20E能與 EcR-B1D/USPD二聚體結(jié)合，EcR-B1D/USPD二聚體能與EcRE結(jié)合，20E-EcR-B1D/USPD組成的復(fù)合體也能與EcRE結(jié)合。這為20E通過(guò)EcR-B1D/USPD誘導(dǎo)絲蛋白基因表達(dá)的這種模式提供了新的證據(jù)。
　　本研究從轉(zhuǎn)錄水平上詳細(xì)闡明了20E及JH對(duì)Ser-1、Fib-H、Fib-L和P25基因表達(dá)作用的基本規(guī)律。另外，通過(guò)ITC技術(shù)檢測(cè)了EcR-B1D/US