熱休克蛋白同源物Hsc70等5種基因在蛻皮激素信號(hào)途徑中的功能及相互作用研究.pdf

1、昆蟲的蛻皮和變態(tài)受20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)和倍半萜類保幼激素(iuvenile hormone,JH)的雙重作用。20E起始了蛻皮生理過(guò)程,而保幼激素則決定著蛻皮的性質(zhì)。20E通過(guò)和蛻皮激素受體(ecdysteroid receptor,EcR)結(jié)合,再與超氣門蛋白(ultraspiracle protein,USP)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,繼而起始了蛻皮級(jí)聯(lián)反應(yīng),一些早期的蛻皮受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子開

2、始轉(zhuǎn)錄,包括EcR、USP、E74、E75以及激素接受子3(HR3)。隨后,激素信號(hào)途徑中的若干晚期基因被誘導(dǎo)表達(dá),從而介導(dǎo)了蛻皮進(jìn)程。保幼激素是一種調(diào)控昆蟲生活史的關(guān)鍵激素,在維持蛻皮期間的幼蟲狀態(tài)和引導(dǎo)昆蟲的生殖成熟方面發(fā)揮了重要作用。保幼激素可能通過(guò)與其可能受體Met相結(jié)合來(lái)調(diào)控幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　 EcR/USP轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中還有伴侶蛋白參與,如熱休克蛋白Hsp90和熱休克蛋白同源物Hsc70是該異源復(fù)合物的組成部分,伴

3、侶蛋白與EcR/USP形成的異源復(fù)合物對(duì)于EcR/USP的DNA結(jié)合活性的發(fā)揮是必不可少的。但對(duì)伴侶蛋白如何調(diào)控EcR/USP的DNA結(jié)合活性的分子機(jī)制并不清楚。
　　 本文鑒定了一個(gè)新的棉鈴蟲表皮細(xì)胞系,建立了可被激素誘導(dǎo)和可進(jìn)行RNA干擾的細(xì)胞系模型。在此基礎(chǔ)上檢測(cè)了一系列受20E調(diào)控的基因的表達(dá)模式。借助細(xì)胞系RNAi鑒定了蛻皮激素受體EcRB1和超氣門蛋白USP1及熱休克蛋白同源物Hsc70在20E信號(hào)途徑中的功能及作用

4、機(jī)理。此外,還鑒定了兩個(gè)受20E上調(diào)的激酶(鳥苷酸激酶和腺苷酸激酶1),為研究20E信號(hào)途徑提供了有效的分子靶標(biāo)。
　　 1.棉鈴蟲表皮細(xì)胞系鑒定及蛻皮激素誘導(dǎo)模型和RNA干擾模型的建立
　　 通過(guò)標(biāo)記基因鑒定了HaEpi為表皮細(xì)胞系。棉鈴蟲表皮細(xì)胞系HaEpi由本實(shí)驗(yàn)室邵紅蓮建立,該論文的工作是用各種標(biāo)記基因鑒定細(xì)胞系,證明其沒有其它組織污染。研究結(jié)果表明,兩種表皮蛋白(Ha-cup1和Ha-cup4)與Ha-tryp

5、sin2在表皮組織和表皮細(xì)胞系中表達(dá),但在血淋巴中無(wú)表達(dá)。相反,Ha-cathL在血淋巴中特異表達(dá),但在表皮細(xì)胞和其它三種組織中無(wú)表達(dá)。在細(xì)胞系上未檢測(cè)到在中腸組織特異表達(dá)的hmg176和在脂肪體中特異表達(dá)的hexamerine。這些結(jié)果表明該HaEpi系的基因表達(dá)模式與表皮組織一致,但不同于血細(xì)胞、中腸和脂肪體,說(shuō)明HaEpi系確屬表皮組織來(lái)源的表皮細(xì)胞系。
　　 建立了在JaEpi系上進(jìn)行20E誘導(dǎo)和進(jìn)行RNA干擾的方法。N

6、orthern blot結(jié)果表明,非甾醇類的20E類似物RH-2485處理后的細(xì)胞中蛻皮激素信號(hào)途徑中的標(biāo)記分子HHR3的表達(dá)量上調(diào)。HHR3的主帶在處理后3小時(shí)內(nèi)就開始表達(dá),12小時(shí)后達(dá)到最高峰,然后逐漸下降,而其他三條帶的表達(dá)相對(duì)較弱。當(dāng)我們用HHR3的雙鏈RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉默HHR3后,RT-PCR結(jié)果顯示HHR3的表達(dá)量顯著降低。這些結(jié)果表明HaEpi是一個(gè)可被20E誘導(dǎo)和可進(jìn)行RNA干擾的細(xì)胞系。這為我們利用RNAi檢測(cè)基因的功

7、能提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 利用該可誘導(dǎo)的細(xì)胞系模型檢測(cè)了20E對(duì)一系列基因表達(dá)的調(diào)控。這些基因包括HaEcRB1,HaUSP1,E74A,E75B,HHR3,ecdysteroid-regulated gene(ecdy),carbA2,nuclear transfer factor2(NTF2),gamma subunit of guanine nucleotide binding protein(G-pro-γ)和

8、Ha-cup1。結(jié)果顯示,用1μM20E處理細(xì)胞不同時(shí)間段后,幾乎所有被檢測(cè)的基因的表達(dá)量都上調(diào)。蛻皮激素受體EcRB1的表達(dá)量在處理后的3-12 h內(nèi)最高,而USP1要在處理12 h后才有明顯表達(dá)。其它兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子E74a和E75b的表達(dá)在處理3 h后也明顯上調(diào)。HHR3經(jīng)20E處理后在3 h內(nèi)就開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)并且在12小時(shí)后達(dá)到高峰,隨后逐漸下降。蛻皮激素相關(guān)蛋白ecdy和羧肽酶A2(carbA2)的表達(dá)量也上調(diào)。核轉(zhuǎn)移因子2(NTF

9、2)和G蛋白γ亞基(G-proy)也可以被20E誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。當(dāng)用20E先處理細(xì)胞12 h而后再撤掉激素繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間段后,EcRB1,USP1和HHR3的表達(dá)在撤掉激素6 h后就消失了,其它基因的表達(dá)量也相繼下降,而表皮蛋白1(cup1)在撤除激素后仍持續(xù)表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明20E調(diào)控這一組基因的表達(dá),并且EcRB1,USP1和HHR3等上游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)依賴于20E的存在。
　　 該部分研究得到如下結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)室前期建立的H

10、aEpi系確屬表皮組織來(lái)源的表皮細(xì)胞系；HaEpi系是一個(gè)可誘導(dǎo)和可干擾的細(xì)胞系；20E可以誘導(dǎo)HaEcRB1等一組基因的上調(diào)表達(dá)。綜上,該細(xì)胞系可以用來(lái)研究激素的調(diào)控效應(yīng),并且通過(guò)進(jìn)行RNAi極大地方便了基因功能的研究。
　　 2.棉鈴蟲蛻皮激素受體HaEcRB1、超氣門蛋白HaUsP1和熱休克蛋白同源物Hsc70在20E信號(hào)途徑中的功能研究
　　 為了研究蛻皮激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)理,分別克隆得到了棉鈴蟲蛻皮激素受體H

11、aEcRB1,超氣門蛋白HaUSP1及熱休克蛋白同系物HaHsc70的全長(zhǎng)序列。HaEcRB1全長(zhǎng)1871bp,編碼545個(gè)氨基酸。HaUSP1全長(zhǎng)2290bp,編碼414個(gè)氨基酸。HaHsc70全長(zhǎng)2145bp,編碼654個(gè)氨基酸。DNAman多重序列比對(duì)結(jié)果表明,HaEcRB1,HaUSP1和HaHsc70分別與同源物種的相似性非常高。HaEcRB1與煙芽夜蛾Heliothis virescens(O18473)的相似性達(dá)96％;H

12、aUSP1與印度古螟P.interpunctella(AY619987)的相似性為91％；HaHsc70與煙草天蛾M.sexta(AY220911)的相似性高達(dá)98％。
　　 進(jìn)一步用半定量RT-PCR研究了HaEcRB1、HaUSP1和HaHsc70在棉鈴蟲的組織分布和發(fā)育階段表達(dá)模式。結(jié)果顯示,HaEcRB1和HaUSP1的轉(zhuǎn)錄子在表皮、中腸、脂肪體和血細(xì)胞中都有表達(dá),而在5齡蛻皮和6齡變態(tài)時(shí)期的表達(dá)量明顯高于5齡取食時(shí)期。

13、HaHsc70在四種組織中也都有表達(dá),但它的轉(zhuǎn)錄本水平在各個(gè)時(shí)期是一致的。說(shuō)明這三種基因在各種組織中廣泛表達(dá),但HaEcRB1和HaUSP1在蛻皮和變態(tài)時(shí)存在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控,而HaHsc70屬于組成性表達(dá)。體外20E誘導(dǎo)細(xì)胞和體內(nèi)注射20E的結(jié)果顯示,20E可以誘導(dǎo)HaHsc70上調(diào)表達(dá),而保幼激素類似物methoprene未影響HaHsc70的表達(dá)水平。
　　 為了闡明這些基因在蛻皮激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的功能,我們?cè)诒砥ぜ?xì)胞系上將

14、HaEcRB1、HaUSP1和HaHsc70分別沉默,然后用RT-PCR檢測(cè)了HaEcRB1,HaUSP1,E74A,E75B,HHR3,ecdy,carbA2,NTF2,G-pro-γ,HaHsc70,Hsp90和印apoptosisinhibitor(apoi)等12個(gè)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,分別干擾HaUSP1、HaEcRB1和HaHsc70后,一系列基因的表達(dá)被抑制,包括轉(zhuǎn)錄因子E74A,E75B和HHR3,還有效應(yīng)基因ecd

15、y以及伴侶蛋白Hsc70,但NTF2、G-pro-γ、Hsp90和apoi的表達(dá)量未變化。有趣的是,在沉默HaHsc70后,HaEcRB1和HaUSP1表達(dá)明顯被抑制了,而分別干擾HaEcRB1、HaUSP1并不互相抑制對(duì)方的表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明HaEcRB1、HaUSP1和HaHsc70可能位于20E信號(hào)途徑的上游發(fā)揮作用。
　　 為了闡明HaHsc70參與蛻皮激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)理,進(jìn)行了HaHsc70亞細(xì)胞定位研究。免疫細(xì)胞化學(xué)

16、結(jié)果顯示,在DMSO處理的對(duì)照組細(xì)胞中,HaHsc70定位于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)用20E處理細(xì)胞后,HaHsc70部分遷入核內(nèi)。然而,在methoprene處理細(xì)胞后,未觀察到HaHsc70的質(zhì)核遷移。相反,HaEcRB1和HaUSP1在未處理的細(xì)胞中主要位于細(xì)胞核中,用20E處理細(xì)胞后,HaEcRB1和HaUSP1在細(xì)胞核中的表達(dá)量明顯增加。然而,將HaHsc70干擾后,HaEcRB1和HaUSP1在細(xì)胞核中的信號(hào)明顯減弱。說(shuō)明20E可使Ha