百脈根共生信號途徑中CASTOR及其相互作用蛋白的研究.pdf

1、CASTOR編碼百脈根(Lotusjaponicus)中的離子通道蛋白，它是共生途徑上的功能基因，作用于結(jié)瘤因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的鈣離子激增(calcium spiking)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游，突變后不能形成根瘤。 為了進一步揭示CASTOR調(diào)控共生信號途徑的分子機制，本文構(gòu)建了百脈根的cDNA文庫，并通過酵母雙雜交系統(tǒng)在百脈根的cDNA文庫中篩選可能與CASTOR相互作用的蛋白。 以接種根瘤菌(Mesorhizobium lo

2、ti)后2，4，8，12d的百脈根植株為材料提取總RNA，按照酵母雙雜交試劑盒提供的方法構(gòu)建百脈根的cDNA文庫。文庫構(gòu)建后經(jīng)有限稀釋法測定的cDNA文庫效率為2×10<'6>個轉(zhuǎn)化子/3ug pGADT7-Rec。菌落PCR顯示文庫的eDNA片段大部分在500bp至2kb之間，文庫構(gòu)建較成功而且無污染。 成功構(gòu)建了CASTOR-RCK-BD重組質(zhì)粒，并以其為誘餌篩選百脈根的cDNA3文庫。初篩獲得111個陽性克隆，經(jīng)x-Gal

3、檢測以及回轉(zhuǎn)酵母驗證進一步確認有99個藍色克隆子，測序以及NCBI BLASTk對分析鑒定JAB1、clpA、鈣調(diào)素結(jié)合的翻譯延伸因子等7種可能與CASTOR相互作用的蛋白。其中陽性克隆中鈣調(diào)素結(jié)合的翻譯延伸因子的數(shù)目最多，占總數(shù)的30％以上，而且蛋白的同源性也達到了90％，經(jīng)DNAMAN等軟件分析發(fā)現(xiàn)它們可以分為5類。 利用RT-PCR方法檢測了這些基因在接種以及不接種根瘤菌的百脈根中的表達水平，結(jié)果顯示鈣調(diào)素結(jié)合的翻譯延伸因