碳納米材料對百脈根共生固氮生物效應(yīng)及作用機(jī)制的研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氮肥問題是世界各國科學(xué)家長期以來致力于解決的重大課題之一。其中糧食增產(chǎn)對氮肥需求的壓力和過度使用工業(yè)氮肥對環(huán)境的污染，促使豆科植物共生固氮成為當(dāng)前生物領(lǐng)域的一個研究熱點。通過提升豆科共生固氮的能力來減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氮肥使用量，是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要方面。當(dāng)前納米技術(shù)的快速發(fā)展推動著納米材料在生物相關(guān)領(lǐng)域的廣泛研究和應(yīng)用，其中大量研究發(fā)現(xiàn)碳納米材料（Carbon Nanomaterials，CNMs）能影響植物的生長發(fā)

2、育和生化反應(yīng)過程，導(dǎo)致納米生物效應(yīng)的產(chǎn)生。然而，至今仍缺乏在豆科共生固氮領(lǐng)域進(jìn)行CNMs研究或應(yīng)用的相關(guān)報道，因此本研究致力于探索CNMs對豆科共生固氮的影響進(jìn)而豐富對納米生物效應(yīng)的認(rèn)知，并且希望能從中尋找到新的方式來提升豆科植物固氮能力，為今后CNMs在植物生物技術(shù)中的應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。本文以三種重要的碳納米材料:氧化單壁碳納米管(o-SWCNTs)，氧化多壁碳納米管(o-MWCNTs)和氧化石墨烯(GO)為基礎(chǔ)，利用化學(xué)表征、

3、數(shù)據(jù)比較分析、電鏡觀察以及基因表達(dá)分析等技術(shù)手段研究了CNMs對豆科模式植物百脈根(Lotus japonicus)共生固氮過程的影響，并深入探討了o-MWCNTs在這一生理過程中的作用機(jī)制。
　　本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過檢測細(xì)菌生長曲線和平板菌落數(shù)，分別研究了o-SWCNTs，o-MWCNTs和GO對百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti MAFF303099)生長活性的影響。實驗結(jié)果顯示，o-MW

4、CNTs在不同濃度下對根瘤菌的生長活性都沒有明顯的影響;而500μg/mL o-SWCNTs和50μg/mL GO卻能明顯降低根瘤菌的生長速率，這些結(jié)果表明o-SWCNTs和GO對根瘤菌的毒性要比o-MWCNTs高。
　　2.在自生（非接種根瘤菌）條件下，分別研究了o-SWCNTs，o-MWCNTs和GO對百脈根生長發(fā)育的影響。實驗結(jié)果顯示，o-MWCNTs能夠顯著促進(jìn)植物莖葉的生長，但并不影響根的生長;而o-SWCNTs和GO卻

5、對根的發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，使得根長度顯著變短。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度o-MWCNTs在植物不同培養(yǎng)條件下依然產(chǎn)生加速莖葉生長的作用，由此證明o-MWCNTs對百脈根生長發(fā)育具有一定的促進(jìn)效應(yīng)。
　　3.在共生（接種根瘤菌）條件下，重點研究了CNMs對百脈根共生固氮過程的影響。初步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與o-SWCNTs和GO的處理相比較，o-MWCNTs能增加接種14天后(14dpi)植物的結(jié)瘤數(shù)。進(jìn)一步的實驗結(jié)果顯示，從14dpi開始

6、一直到28dpi不同濃度o-MWCNTs都能顯著提高植物的根瘤數(shù)，與空白對照相比增加了40％;而且不同濃度o-MWCNTs也能明顯增強(qiáng)植物生長28dpi后的根瘤固氮酶活性。在上述兩方面的綜合作用下，o-MWCNTs處理后植物的生物量得到顯著提高。以上結(jié)果表明o-MWCNTs對百脈根的結(jié)瘤數(shù)和固氮能力都具有正向生物效應(yīng)。
　　4.利用拉曼光譜和透射電鏡對百脈根的根和根瘤細(xì)胞中的o-MWCNTs進(jìn)行定性分析。通過拉曼光譜在植物根和根瘤

7、細(xì)胞中檢測到了CNMs所特有的G和D兩個特征峰，可以推斷o-MWCNTs存在于這兩種細(xì)胞中。隨后，TEM的觀察結(jié)果驗證了這一推斷，不管是在根還是根瘤細(xì)胞中都能觀察到o-MWCNTs的存在。這些實驗數(shù)據(jù)表明，o-MWCNTs與百脈根相接觸后能穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，最終進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中。
　　5.利用Real-time PCR詳細(xì)分析了o-MWCNTs處理下百脈根共生固氮過程中相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，o-MWCNTs能提升早期結(jié)