SIGIRR在急性肺損傷中的作用及其相互作用蛋白的篩選與初步研究.pdf

1、1. 背景與目的
　　 急性肺損傷(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distresssyndrome, ARDS)是由炎癥失控而引起的臨床危急重癥，目前尚缺乏有效的特異性治療。Toll 樣受體(Toll like receptors, TLRs)是固有免疫系統(tǒng)中的主要病原模式受體之一，TLR信號通路的過度激活是導致炎癥反應(yīng)爆發(fā)失控的重要機制。單免疫球蛋白白介

2、素-1受體相關(guān)蛋白(single immunoglobin IL-1receptor related protein, SIGIRR)是新近發(fā)現(xiàn)的Toll 樣受體/白介素-1受體(Toll like receptor/Interleukin-1receptor, TIR)超家族成員，又稱為TLR-IL-1R8 (TIR8)，是TLR信號通路中的負性調(diào)控分子。但目前有關(guān)SIGIRR在急性肺損傷中的確切作用尚未見報道。SIGIRR的負性調(diào)控

3、機制可能與其“俘獲”TLR-IL-1R (TIR)信號通路中的關(guān)鍵組分而抑制TIR信號的轉(zhuǎn)導有關(guān)，但具體的分子機制仍有待進一步闡明。SIGIRR的胞內(nèi)段TIR 域是其發(fā)揮功能的重要結(jié)構(gòu)，目前已證實，SIGIRR能通過胞內(nèi)段TIR 域與TIR信號通路中IL-1R 或TLR4 受體復(fù)合物發(fā)生相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)間相互作用的高效的新技術(shù)，通過以已知功能的蛋白質(zhì)基因篩選雙雜交cDNA文庫，可發(fā)現(xiàn)與已知蛋白分子有相互作用的新分子并

4、推測新分子可能的功能。鑒于此，本課題擬通過構(gòu)建腺病毒表達載體上調(diào)SIGIRR在肺內(nèi)的表達，在內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠模型中確定SIGIRR的作用；通過酵母雙雜交系統(tǒng)，在人肺cDNA文庫中篩選與SIGIRR 有相互作用的蛋白并對有意義的陽性克隆進行初步研究；以期闡明SIGIRR在ALI中的確切作用及SIGIRR 負性調(diào)控TIR信號的機制，并為ALI/ARDS的防治提供新的作用靶點。
　　 2.方法
　　 (1) 重組SIGIR

5、R基因腺病毒表達載體的構(gòu)建與鑒定以pCMV-SPORT6-mSIGIRR為模板保真擴增小鼠源性murine SIGIRR (mSIGIRR)基因，經(jīng)過酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建重組質(zhì)粒pDC316-mSIGIRR，并行酶切和測序鑒定；
　　 采用AdMaxTM 包裝系統(tǒng)，將穿梭質(zhì)粒pDC316-mSIGIRR和骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1,3Cre共轉(zhuǎn)入包裝293細胞中，構(gòu)建攜帶mSIGIRR基因的重組腺病毒載體Ad.mSIGIRR；通

6、過PCR 擴增、病毒顆粒吸光度值測定及TCID50的方法，對重組腺病毒Ad.mSIGIRR的質(zhì)量和滴度進行鑒定；建立Ad.mSIGIRR 體內(nèi)外的感染模型，利用Western blot、免疫組化和肺組織切片HE 染色的方法，對Ad.mSIGIRR在真核細胞與肺內(nèi)的表達效力及對宿主肺部病理改變的影響進行檢測。
　　 (2) SIGIRR 過表達對小鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的保護作用用經(jīng)鼻滴注的方法，以4×107 PFU/只的劑量建立小

7、鼠重組腺病毒Ad.mSIGIRR 感染模型，同時用空病毒載體Ad.V作為對照。感染48 h后，以LPS (15 mg/kg)腹腔注射復(fù)制內(nèi)毒素性急性肺損傷模型。在LPS 刺激后的各個時間節(jié)點，用RT-PCR、Westernblot和免疫組化的方法比較Ad.mSIGIRR組和Ad.V組之間SIGIRR的表達情況；同時對比兩組間的肺組織病理改變、肺損傷評分情況以及模型小鼠的7天存活率的變化；
　　 用ELISA 法和硝酸還原酶法分別

8、檢測兩組肺內(nèi)和血清中TNF-α及肺內(nèi)NO 含量變化；
　　 用鄰連茴香胺-比色法檢測兩組肺內(nèi)MPO 活性變化；用EMSA和ELISA兩種方法比較兩組間肺內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NFκB的活性。
　　 (3) SIGIRR 相互作用蛋白的篩選與初步研究以pReceiver-LV19-SIGIRR 質(zhì)粒為模板保真擴增獲得人SIGIRR 胞內(nèi)區(qū)(480-1230bp)基因片段，經(jīng)過酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建重組誘餌質(zhì)粒pSos-SIGIRR，并行

9、酶切和測序鑒定；按照stratagene 公司CytoTrap yeast two-hybrid 體系的說明行溫度敏感型酵母菌的表型與回復(fù)突變鑒定以及誘餌質(zhì)粒自激活檢測后，將誘餌質(zhì)粒pSos-SIGIRR與人肺cDNA文庫質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細胞篩選鑒定與SIGIRR 胞內(nèi)區(qū)相互作用的蛋白，免疫共沉淀的方法進一步驗證篩選結(jié)果；應(yīng)用生物信息學的方法，分析比對陽性克隆序列，同時查閱相關(guān)文獻選取有意義的陽性克隆為對象進行后繼研究；用RT-P

10、CR的方法檢測paralemmin-3在人肺泡上皮細胞系(A549細胞)中有無表達；用Realtime-PCR的方法比較A549細胞中，LPS 刺激后SIGIRR和paralemmin-3的表達變化；用RNA干擾的方法下調(diào)A549細胞中paralemmin-3的表達，觀察paralemmin-3對LPS 誘導的A549細胞炎癥因子釋放的影響。
　　 3.結(jié)果
　　 (1) 成功構(gòu)建了攜帶小鼠源性SIGIRR基因的重組腺病

11、毒表達載體Ad.mSIGIRR，病毒顆粒數(shù)和感染滴度分別為：4.65×1011VP/ mL和4×109 PFU/mL，符合實驗要求；
　　 Western blot和免疫組化的方法分別檢測到mSIGIRR在體內(nèi)外的高效表達，且經(jīng)鼻滴注感染宿主后，不會引起宿主肺組織發(fā)生病理變化。(2) SIGIRR組成性表達于正常小鼠肺組織，主要分布于肺上皮細胞。LPS 腹腔注射后，小鼠肺內(nèi)SIGIRR的表達下調(diào)，但與正常小鼠及Ad.V對照組相比

12、，Ad.mSIGIRR組小鼠肺內(nèi)SIGIRR表達顯著增加(P＜0.05)；與Ad.V對照組相比，Ad.mSIGIRR組小鼠肺組織的病變減輕、炎癥介質(zhì)TNF-α和NO 含量減少、肺內(nèi)MPO和NFκB 活性降低、肺損傷小鼠7天存活率顯著提高(P＜0.05)。
　　 (3)通過酵母雙雜交實驗，共篩選到4個與SIGIRR 胞內(nèi)區(qū)之間存在可能相互作用的陽性克隆，分別是：Homo sapiens mitochondrion, complet

13、e genome；Homo sapienscyclin H (CCNH), mRNA；Homo sapiens paralemmin-3 (PALM3), mRNA；Homo sapiensv-ki-ras2 kirsten rat sarcoma virAloncogene homolog (KRAS), mRNA；其中Homo sapiensmitochondrion, complete genome為非編碼序列，KRAS為Cyto

14、trap 酵母雙雜交系統(tǒng)中的背景性假陽性蛋白，CCNH為細胞周期素H 定位于細胞核，與SIGIRR 缺少共同物理空間定位。而PALM3為paralemmin蛋白家族成員，定位于細胞膜，與SIGIRR 有共同物理空間定位，因此選擇PALM3作為后繼研究的對象；免疫共沉淀結(jié)果進一步驗證了PALm3與SIGIRR 間的相互作用；RT-PCR 檢測證實PALM3在A549細胞中有表達，LPS 刺激后，SIGIRR的表達下調(diào)而PALM3的表達上調(diào)

15、；沉默PALM3的表達，減少LPS 誘導的A549細胞炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放(P＜0.05)。
　　 4.結(jié)論
　　 (1) LPS 刺激后，小鼠肺內(nèi)SIGIRR的表達下調(diào)，增強小鼠肺內(nèi)SIGIRR的表達能通過負性調(diào)控LPS-TLR4信號的轉(zhuǎn)導而對內(nèi)毒素性急性肺損傷起保護作用；
　　 (2)通過酵母雙雜交及免疫共沉淀實驗，我們證實PALM3是SIGIRR 新的相互作用分子，LPS 刺激