DJ-1基因在肺癌中的作用及其相互作用蛋白分析.pdf

1、目的：為了闡明DJ-1蛋白在肺癌中的作用及尋找其相互作用蛋白，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)DJ-1基因在肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1和HTB-182中的表達(dá)，分析DJ-1表達(dá)下調(diào)對(duì)SK-MES-1和HTB-182細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。然后轉(zhuǎn)染DJ-1表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)串聯(lián)親和純化質(zhì)譜(TAP-MS)技術(shù)尋找DJ-1相互作用蛋白，探討DJ-1的分子作用機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建靶向DJ-1基因siRNA慢病毒載體（重組慢病毒中含有綠色熒光蛋白標(biāo)記）

2、，感染SK-MES-1和HTB-182細(xì)胞(DJ-1 siRNA組)，并設(shè)立慢病毒載體對(duì)照組(Blank negative control group;NC組)及空白對(duì)照組(Blankcontrol;BC組)。用熒光顯微鏡確定感染效率，Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中DJ-1蛋白表達(dá)水平，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期(FCM)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外遷移侵襲能力。另外，構(gòu)建帶有鏈霉

3、素結(jié)合肽標(biāo)簽(SBP)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽標(biāo)簽(CBP)的DJ-1表達(dá)質(zhì)粒，用脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DJ-1 siRNA HTB-182和HTB-182、DJ-1siRNASK-MES-1和SK-MES-1細(xì)胞，TAP-MS技術(shù)以尋找DJ-1的相互作用蛋白。
　　結(jié)果：與陰性對(duì)照組(blank negative control;NC組)及空白對(duì)照組(blank control;BC組)比較，DJ-1 siRNA組的DJ-1蛋白表達(dá)明顯受到抑制

4、，MTT結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力明顯減弱，F(xiàn)CM結(jié)果表明G1/G2期細(xì)胞數(shù)增多和S期細(xì)胞數(shù)減少，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞周期受阻、細(xì)胞體外遷移和侵襲能力顯著減弱（P＜0.05）。另外成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)PNTAPB-DJ-1質(zhì)粒的四株細(xì)胞系，為尋找DJ-1蛋白的相互作用蛋白質(zhì)打下基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：D J-1基因具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和體外遷移侵襲的作用。成功構(gòu)建DJ-1質(zhì)粒穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，并鑒定了三個(gè)潛在的DJ-1蛋白相互作用蛋白