大鼠缺血—再灌注損傷心肌中Hsc70相互作用蛋白組學(xué)及其心肌保護(hù)作用研究.pdf

1、缺血心肌恢復(fù)血流灌注過程中產(chǎn)生的心肌損傷,稱為心肌缺血一再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI),常見于冠心病等心血管疾病及外科心血管疾病治療過程。心肌缺血-再灌注損傷的發(fā)生涉及活性氧產(chǎn)生、鈣超載及能量代謝障礙等機(jī)制,其結(jié)果是導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡。由過氧化氫、超氧陰離子、羥自由基等活性氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激在心肌缺血-再灌注損傷的發(fā)生過程中起著重要作用。
　　近年來,不少學(xué)者重視

2、細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制在疾病防治中的作用,關(guān)注焦點(diǎn)之一是熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)。HSPs是細(xì)胞在生理狀態(tài)下必需而在應(yīng)激狀態(tài)(特別是熱應(yīng)激)時(shí)表達(dá)增多的一類保護(hù)性蛋白質(zhì)。HSPs的主要功能是分子伴娘(molecular chaperone)功能,即參與蛋白質(zhì)的正確折疊、解聚、復(fù)性和協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)等。熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)是HSPs家族中最為重要的成員。熱休克蛋

3、白70可分為組成型Hse70和誘導(dǎo)型Hsp72兩種,它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能方面類似。作為一個(gè)細(xì)胞中預(yù)先存在的分子伴侶,Hsc70具有顯著的抗心肌缺血及其他損傷作用。盡管已經(jīng)取得了上述進(jìn)展,但心肌損傷時(shí),Hsc70究竟與哪些分子相互作用從而發(fā)揮其心肌保護(hù)功能,目前仍不十分清楚。
　　為了篩選Hsc70相互作用的蛋白質(zhì),本研究采用ADP親和層析分離純化正常大鼠心肌和缺血.再灌注損傷心肌中的Hsc70相互作用蛋白,應(yīng)用二維凝膠電泳(two-d

4、imensional gel electrophoresis,2-DE)技術(shù)進(jìn)一步分離上述Hsc70相互作用蛋白質(zhì),采用圖像分析識(shí)別正常心肌組織和缺血-再灌注損傷心肌組織中Hsc70相互作用差異蛋白質(zhì)點(diǎn),采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定差異蛋白質(zhì),然后采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)和體外蛋白質(zhì)重疊實(shí)驗(yàn)(protein overlay assays)對(duì)相互作用關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證

5、。為了探討Hsc70抗心肌細(xì)胞損傷的具體機(jī)制,采用基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)檢測了Hsc70過表達(dá)和表達(dá)抑制對(duì)過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)所致的相互作用蛋白GAPDH、ENOA和ALDH2的表達(dá)和活性的影響;以及Hsc70過表達(dá)和表達(dá)抑制對(duì)過氧化氫所致的心肌細(xì)胞損傷的影響。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、大鼠缺血-再灌注損傷心肌中Hsc70相互作用蛋白的初步篩選
　　(1)大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型

6、的構(gòu)建:結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支30分鐘后再灌注60分鐘,血清中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)明顯增多。TTC染色顯示,與假手術(shù)組相比,缺血.再灌注損傷組心肌梗死面積明顯增加,提示心肌缺血.再灌注損傷模型構(gòu)建成功。
　　(2)大鼠缺血-再灌注損傷心肌中Hsc70相互作用蛋白2-DE圖譜的建立與分析:采用ADP親和層析技術(shù)從正常心肌組織和缺血-再

7、灌注損傷心肌中分離純化Hsc70及其相互作用蛋白,應(yīng)用2-DE技術(shù)建立了正常心肌和缺血.再灌注損傷心肌的Hsc70相互作用蛋白2-DE圖譜,圖像分析識(shí)別了56個(gè)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn),采用MALDI-TOF-MS鑒定了32個(gè)蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)32個(gè)蛋白質(zhì)中有21個(gè)為代謝相關(guān)蛋白,其功能主要涉及能量代謝、氧化磷酸化及電子傳遞等方面,說明Hsc70可能通過與這些蛋白質(zhì)的相互作用,在改善能量代謝、清除自由基等方面發(fā)揮心肌內(nèi)源性保護(hù)作用。
　　2、

8、大鼠缺血-再灌注損傷心肌中Hsc70相互作用蛋白的驗(yàn)證
　　抽提正常和缺血.再灌注損傷大鼠心肌以及正常和暴露于H2O2的大鼠心肌細(xì)胞裂解液,應(yīng)用Hsc70抗體進(jìn)行免疫沉淀后,對(duì)沉淀物中的蛋白應(yīng)用不同抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明,在正常大鼠心肌和H9c2心肌細(xì)胞中,Hsc70與ENOA、GAPDH和ALDH2結(jié)合,氧化應(yīng)激損傷時(shí),Hsc70也可與ENOA、GAPDH和ALDH2結(jié)合,但是結(jié)合并沒有明顯差別。通過體外

9、蛋白質(zhì)重疊實(shí)驗(yàn),我們還發(fā)現(xiàn)Hsc70可與ENOA、GAPDH直接結(jié)合。
　　3、從分子伴侶角度研究Hsc70保護(hù)過氧化氫所致心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制
　　(1)Hsc70對(duì)H2O2所致的ENOA、GAPDH和ALDH2表達(dá)的影響:
　　以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)為載體構(gòu)建Hsc70的全長真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-Hsc70,將Hsc70全長表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞,采用Western blot分析

10、證明細(xì)胞中的Hsc70表達(dá)明顯增加。將Hsc70RNA干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染心肌H9c2細(xì)胞,Western blot分析發(fā)現(xiàn)Hsc70在心肌細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)。
　　正常情況下,ENOA的表達(dá)在Hsc70過表達(dá)和Hsc70RNA干擾細(xì)胞中沒有明顯變化。H2O2處理后,心肌細(xì)胞中ENOA表達(dá)上調(diào),Hsc70過表達(dá)和Hsc70RNA干擾對(duì)H2O2所致的ENOA表達(dá)沒有明顯影響。
　　正常情況下,GAPDH和ALDH2的表達(dá)在Hsc7

11、0過表達(dá)和Hsc70低表達(dá)心肌細(xì)胞中沒有明顯改變。H2O2處理后,Hsc70過表達(dá)和Hsc70RNA干擾對(duì)GAPDH和ALDH2的表達(dá)也沒有影響。
　　以上結(jié)果說明在H2O2所致的大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中,Hsc70過表達(dá)和表達(dá)抑制均不影響ENOA、GAPDH和ALDH2的表達(dá)。
　　(2)Hsc70對(duì)H2O2所致的ENOA、GAPDH和ALDH2活性的影響:
　　收集正常和H2O2處理后的心肌細(xì)胞,檢測細(xì)胞中ENO

12、A、GAPDH的活性,發(fā)現(xiàn)正常情況下Hsc70過表達(dá)和低表達(dá)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞中ENOA和GAPDH活性沒有明顯影響。經(jīng)H2O2處理后,大鼠心肌細(xì)胞中ENOA和GAPDH活性降低,但Hsc70過表達(dá)抑制了H2O2所致的ENOA和GAPDH活性下降,而Hsc70低表達(dá)促進(jìn)了H2O2所致的ENOA和GAPDH活性下降。
　　采用50μmol/L的ALDH2的特異性抑制劑daidzin預(yù)處理心肌細(xì)胞后,收集正常和H2O2處理后的心肌細(xì)胞,檢

13、測細(xì)胞中ALDH2的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常情況下,Hsc70過表達(dá)或低表達(dá)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的ALDH2活性沒有明顯影響。Daidzin預(yù)處理后,細(xì)胞中ALDH2活性降低了50％。經(jīng)H2O2處理后,大鼠心肌細(xì)胞中ALDH2活性降低,而daidzin預(yù)處理再經(jīng)H2O2處理后ALDH2活性下降更為明顯。Hsc70過表達(dá)明顯抑制了H2O2所致的ALDH2活性降低,Hsc70低表達(dá)促進(jìn)了H2O2所致的ALDH2活性下降。
　　(3)Hsc70對(duì)

14、H2O2所致大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響:
　　Hsc70過表達(dá)對(duì)H2O2所致大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響:應(yīng)用Hsc70真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Hsc70過表達(dá)明顯抑制了H2O2所致的心肌細(xì)胞存活率降低、培基中LDH釋放和細(xì)胞凋亡發(fā)生。
　　Hsc70低表達(dá)對(duì)H2O2所致大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響:應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Hsc70的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Hsc70低表達(dá)進(jìn)一步加劇了H2O2所致的心肌細(xì)胞存活率降低、培基中LDH釋放和細(xì)胞凋亡

15、發(fā)生。
　　Hsc70過表達(dá)和低表達(dá)對(duì)daidzin預(yù)處理后H2O2所致大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響:daidzin預(yù)處理后再經(jīng)H2O2處理比單獨(dú)H2O2處理引起的心肌細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡更為明顯,Hsc70過表達(dá)能夠減輕daidzin預(yù)處理后H2O2所致心肌細(xì)胞損傷,而Hsc70表達(dá)抑制加劇了daidzin預(yù)處理后H2O2所致心肌細(xì)胞損傷。
　　以上結(jié)果表明,在H2O2所致大鼠心肌細(xì)胞損傷中,Hsc70對(duì)H2O2所致的大鼠心肌細(xì)胞

16、損傷具有保護(hù)作用。
　　綜上所述,Hsc70是一個(gè)重要的內(nèi)源性保護(hù)蛋白,在心肌缺血-再灌注損傷中發(fā)揮重要保護(hù)作用。在缺血-再灌注損傷大鼠心肌及氧化應(yīng)激的心肌細(xì)胞中,Hsc70與ENOA、GAPDH和ALDH2存在相互作用,并且Hsc70能夠直接與ENOA、GAPDH結(jié)合。在大鼠H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時(shí),代謝相關(guān)的GAPDH、ENOA和ALDH2活性均降低,這些酶活性的降低可能增加了心肌細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌損傷的易感性。而