Necrostatin-1在大鼠心肌缺血-再灌注損傷中的延遲性心肌保護作用.pdf

1、研究背景: 據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，急性心肌梗死(AMI)是人類心血管疾病最重要的死亡原因之一。AMI常由血栓阻塞冠狀動脈所引起，導(dǎo)致不可逆的心肌細胞死亡。此時，盡早對缺血區(qū)進行血液再灌注是挽救心肌細胞死亡的唯一有效途徑，但是再灌注本身亦會加重缺血后心肌細胞損傷，即再灌注損傷。隨著再灌注后心肌細胞的大量丟失，纖維組織反應(yīng)性增生進而形成瘢痕，不僅導(dǎo)致心功能障礙，嚴重時甚至?xí)T發(fā)心力衰竭。目前越來越多的證據(jù)表明：通過阻斷細胞死

2、亡通路，可以明顯的縮小心肌梗死面積，改善心功能；因此，減少心肌細胞死亡已被認為是一種治療缺血/再灌注損傷的潛在途徑。 長期以來，心肌缺血/再灌注損傷所導(dǎo)致的心肌細胞死亡被分為細胞壞死和凋亡兩種主要形式。盡管細胞壞死在心肌梗死區(qū)中所占比重較大，但凋亡作為程序性細胞死亡形式被認為比細胞壞死更具可調(diào)控性。然而，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)均提示：凋亡并非唯一的程序性死亡方式；在心肌缺血/再灌注損傷中，延遲性細胞壞死也呈現(xiàn)出程序性死亡的特點，如自

3、噬性細胞死亡，也稱程序性細胞死亡Ⅱ型。那么，如果能在信號通路上阻斷這種細胞死亡方式，將有可能尋找出一條治療缺血/再灌注損傷的新途徑。 程序性細胞死亡Ⅱ型在形態(tài)上主要表現(xiàn)為細胞內(nèi)自噬體的大量聚集，自噬作用本身是一種細胞在惡劣環(huán)境下得以存活的自救行為，在一定范圍及程度上的自噬作用對細胞起保護作用，而超出此范圍將會導(dǎo)致細胞損傷。雖然下調(diào)自噬體的形成，如使用自噬體特異性抑制劑--3-甲基腺嘌呤(MA3)，可以有效地阻斷某些病理原因所導(dǎo)致

4、的細胞死亡過程。但近來有許多研究已表明：有些病理原因所導(dǎo)致的細胞死亡，如心肌缺血/再灌注損傷，應(yīng)用MA3不但不能減少細胞的死亡，反而加重了心肌的損傷。因此，有人提出：自噬途徑的上游機制才是調(diào)節(jié)自噬性細胞死亡的關(guān)鍵；但是，由于缺乏合適的工具而限制了對其機制的進一步研究。 2005年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的袁鈞英教授和她的研究小組在《NatureChemical Biology》上報道一種小分子物質(zhì)(簡稱Nec-1)，能夠特異性地抑制Fas

5、/TNFR所誘導(dǎo)的以自噬體積聚為特征的非凋亡性細胞死亡--程序性壞死。這種能被Nec-1所抑制的死亡方式同時兼具了凋亡的程序性特征和自噬性細胞死亡的形態(tài)學(xué)特征。該研究結(jié)果進一步顯示：Nec-1對這種細胞死亡方式的阻斷并非通過抑制細胞的自噬途徑。因此，作者認為Nec-1可能是通過阻斷自噬的上游途徑而抑制這種細胞死亡方式的，而研究Nec-1作用機制將有助于揭示程序性壞死的上游途徑。目前，由于Nec-1能否抑制大鼠心肌缺血/再灌注導(dǎo)致的細胞死

6、亡尚不明確；因而，確定Nec-1對大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的作用將是首要解決的問題。 目的： 1.觀察Nec-1在MI/R過程中是否具有心肌保護作用，進而推斷Necroptosis是否參與了MI/R誘導(dǎo)的心肌損傷。 2.如果上述目的被證實，進一步觀察Nec-1對不同時間點缺血/再灌注心肌的保護作用，以推測在缺血/再灌注中Necroptosis發(fā)生的時間窗。 方法： 雄性SD大鼠，建立在體心肌缺血

7、(12 weeks)或缺血/再灌注模型(130min，R12h、24h、48h、72h)，并分別于缺血前或再灌注時，鼠尾靜脈注射Nec-1或相應(yīng)溶劑，即治療組和溶劑對照組。觀察心肌缺血/再灌注后的左心室功能改變，使用Masson三色染色的方法測定心肌梗死面積并觀察光鏡下受損心肌中纖維組織反應(yīng)性增生以確定左心室重構(gòu)的程度，并檢測再灌注后不同時間點血清肌酸激酶(CK)的含量，從而明確Nec-1在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中是否具有心肌保護作用

8、。然后，通過測定受損心肌組織自噬體標(biāo)志物：MAP-L,C3Ⅱ表達量(Westem blot)，并于電鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)超微結(jié)構(gòu)的改變，從而研究心肌組織中的細胞程序性壞死是否具有自噬的特征。最后，通過分析缺血/再灌注不同時間點上MAP-LC3Ⅱ表達量和血清肌酸激酶活性之間的相關(guān)性，從而確認在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中Nec-1的作用與自噬樣的程序性壞死之間的相關(guān)性。 結(jié)果： 1.Nec-l可以降低MI/R大鼠血清中的C

9、K水平肌酸激酶是心肌中特有的一種分子物質(zhì)，心肌缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)心肌細胞膜破裂，引起血清CK水平的升高，已被普遍地認為是一項反映心肌損傷的重要指標(biāo)。實驗結(jié)果顯示：心肌缺血前，各組大鼠血清CK水平無差別(232±34 U/L)；而在心肌缺血/再灌注后，血清CK水平較缺血前均有顯著性升高，其中以再灌注12h(1433±124U/L)和24h(1438±174 U/L)時血清CK水平升高最為顯著，而再灌注48h和72h時血清CK水平逐漸降低

10、，提示：再灌注24h時的心肌壞死最為嚴重；再灌注早期給予Nec-1后，能夠顯著性降低再灌注12h時(722±111 U/L vs 1433±124U/L)及再灌注24h時(929±271 U/L vs 1438±174 U/L)的血清CK水平；與此相反，使用Nee-1治療后，在再灌注48h時血清CK水平較MI/R+溶劑對照組的反而升高(1238±158 U/L vs 559±175 U/L)，提示：Nee-1治療可以減少心肌細胞的壞死，

11、并能延遲血清CK水平的峰值。 2.Nee-1可以減少大鼠急性MI/R的心梗面積 心肌缺血30min再灌注72h后，由缺血/再灌注引起的心肌梗死，時間依賴性的從心內(nèi)膜擴展到心外膜，導(dǎo)致心梗區(qū)內(nèi)纖維組織反應(yīng)性增生引起間質(zhì)纖維化從左室心肌內(nèi)層擴展到中層；而再灌注早期給予Nee-1后，能夠明顯抑制由缺血/再灌注引起的左心室重塑并使間質(zhì)纖維化限制在心肌內(nèi)層，同時能顯著性地減少心肌梗死面積(15.1±1.7％LV area vs.5

12、.3±2％LV area)，心梗面積比重=左室梗死區(qū)面積/左心室面積。 3.Nee-1對大鼠急性MI/R的心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡下觀察在心肌缺血30min再灌注48h時左心室梗死區(qū)域超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)心肌缺血/再灌注后對照組的左室梗死區(qū)中大量組織崩解，在組織分解區(qū)周圍心肌纖維呈現(xiàn)明顯的空泡化，但心肌纖維中未見自噬體的產(chǎn)生，僅有的少量自噬體均來自于間質(zhì)細胞；而MI/R+Nec-1給藥組左室梗死區(qū)中組織結(jié)構(gòu)保存相對

13、完整，心肌纖維腫脹，空泡化改變少見，部分心肌纖維中可見少量散在的自噬體。上述結(jié)果進一步提示：Nec-1可以有效減少心肌缺血/再灌注所誘導(dǎo)的組織損傷，因而具有明顯的心肌保護作用。 4.Nec-1可以減少大鼠慢性MI的心梗面積 由于慢性心肌缺血能導(dǎo)致更為嚴重的組織細胞壞死，并且在受損的心肌組織中常常伴隨有大量自噬體的產(chǎn)生，因而觀察Nec-1在慢性心肌缺血中的作用，能夠更好地反映Necroptosis在心肌細胞壞死中所占的比重

14、。心肌缺血2周后，由缺血引起的心肌細胞死亡誘導(dǎo)梗死區(qū)內(nèi)纖維組織的反應(yīng)性增生，Masson三色染色后可見左心室缺血區(qū)發(fā)生透壁性梗死；缺血前給予Nee-1后，不僅能顯著地減小慢性心肌缺血的心梗面積并在很大程度上抑制了心肌重塑，同時也明顯地提高了模型大鼠的成活率。 5.Nee-1對大鼠MUR后不同時期心功能的影響 治療心肌缺血/再灌注損傷，心肌缺血前，各組大鼠之間心功能指標(biāo)無差別；冠脈前降支結(jié)扎30min后，各組大鼠之間心功能

15、指標(biāo)較缺血前均顯著性降低。其后，在心肌缺血/再灌注12h和48h時，MI/R+Nec-1組與MI/R+溶劑對照組相比，左心室舒張壓(LVDP)和左心室舒張末壓(LvEDP)均有顯著性降低，并且在缺血/再灌注12h時差異最明顯。 6.Nec-l對大鼠心肌缺血/再灌注后不同時期自噬體的產(chǎn)生情況 由于自噬作為Necroptosis的一種特征性形態(tài)學(xué)改變，可能間接地反映Necroptosis的程度，因而，選用了LC3 II--一

16、種公認可靠的自噬體標(biāo)志物來檢測自噬體的含量，進而間接地衡量Necroptosis發(fā)生的程度。提示：心肌缺血/再灌注后的Necroptosis可能主要發(fā)生在再灌注24h之內(nèi)。 7.自噬體與血清CK水平的相關(guān)性分析及可能的意義 對大鼠心肌缺血/再灌注后不同處理組中心肌組織LC3 Ⅱ表達量與血清CK水平進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：兩參數(shù)總體上呈顯著性正相關(guān)。提示：Nec-1可能通過阻斷以自噬體積聚為特征的非凋亡性細胞死亡方式--Nec

17、roptosis，從而減少大鼠心肌缺血/再灌注損傷所誘導(dǎo)細胞死亡。 結(jié)論： 1.再灌注的同時給予Nec-1可以減輕再灌注所誘導(dǎo)的心肌損傷，同時減少了心肌梗死面積以及梗死區(qū)域的間質(zhì)纖維化程度，并能緩解心肌缺血/再灌注損傷所導(dǎo)致的心功能障礙，尤其使左心室的舒張功能得到明顯改善。 2.缺血前給予Nec-1后，可以明顯地減小慢性心肌缺血所誘導(dǎo)的心肌梗死并能在很大程度上抑制心肌組織的重塑。 3.心肌缺血/再灌注損傷