蕨麻正丁醇部位對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、目的：研究蕨麻正丁醇部位對(duì)大鼠結(jié)扎冠狀動(dòng)脈所致急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其蛋白表達(dá)差異的影響，進(jìn)而探討蕨麻正丁醇部位心肌保護(hù)作用的藥理機(jī)制。
　　 方法：選取雄性SD大鼠隨機(jī)分為手術(shù)對(duì)照組，模型組，蕨麻正丁醇部位49.3mg.kg-1，98.6mg·kg-1，197.2m g·kg-1干預(yù)組，復(fù)方丹參328.6mg·kg-1干預(yù)組。手術(shù)對(duì)照組給予3‰羧甲基纖維素（CMC），連續(xù)灌胃14天，通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立

2、急性心肌缺血再灌注模型。測(cè)定各處理組動(dòng)物心電圖的變化；取心肌組織進(jìn)行常規(guī)HE染色；取血清檢測(cè)LDH、CK、SOD活性及MDA含量；透射電鏡檢測(cè)急性心肌缺血再灌注損傷以后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；提取各組心肌組織蛋白，經(jīng)雙向電泳和銀染得到雙向電泳圖譜，用PDOuest7.0軟件進(jìn)行圖像分析；考馬斯亮藍(lán)染色后，取蛋白點(diǎn)進(jìn)行酶解，再用MALDI-TOF-MS進(jìn)行分析，使用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，鑒定差異蛋白質(zhì)的種類并采用

3、western blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 1.蕨麻正丁醇部位對(duì)大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用：（1）各組心電圖ST段變化：模型組心電圖ST段發(fā)生明顯偏移。與模型組相比，中高劑量蕨麻正丁醇部位給藥組和復(fù)方丹參藥物組心電圖ST段變化幅度明顯降低。（2）HE染色：模型組組織病理學(xué)改變顯著，心肌間質(zhì)出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維嗜酸性變，肌節(jié)斷裂，壞死；蕨麻高、中劑量組心肌損傷程度較模型組減輕，低劑量組與模型

4、組比較未見明顯改善。（3）心肌超微結(jié)構(gòu)的變化：電鏡結(jié)果顯示蕨麻正丁醇高劑量組能夠減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷導(dǎo)致的線粒體腫脹、空泡化，核周間隙擴(kuò)增等超微結(jié)構(gòu)的損傷改變，維持相對(duì)整齊的心肌纖維排列。（4）血清LDH、CK檢測(cè)：與模型組相比，給予中高劑量蕨麻正丁醇部位均可顯著降低缺血再灌注大鼠血清LDH活性（P<0.01）和CK活性（P<0.01）；（5）血清MDA、SOD檢測(cè)：與模型組相比，各濃度蕨麻正丁醇部位均可顯著提高缺血再灌注大鼠血清

5、中SOD活力（P<0.01），減少M(fèi)DA的產(chǎn)生（P<0.01、），且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。
　　 2.大鼠心肌組織蛋白雙向電泳圖譜分析
　　 經(jīng)PDquest軟件分析檢測(cè)到的各組總蛋白點(diǎn)數(shù)：對(duì)照組1003±23，丹參組918±65，低劑量組877±72，中劑量組1046±43，高劑量組891±23，模型組738±69。分離的蛋白點(diǎn)多分布于P14.8-9.0、MW30kDa-70kDa的范圍。模型組與手術(shù)對(duì)照組比較（P<0

6、.05），其中分析后表達(dá)升高的有5個(gè)點(diǎn)，降低的有39個(gè)點(diǎn)，45個(gè)點(diǎn)未見表達(dá)。在表達(dá)升高的5個(gè)點(diǎn)中有1個(gè)點(diǎn)被蕨麻正丁醇部位高，中劑量組及復(fù)方丹參組下調(diào)。在模型組未見表達(dá)的45個(gè)點(diǎn)中，能被三個(gè)劑量組共同上調(diào)的有6個(gè)點(diǎn)，復(fù)方丹參組有3個(gè)點(diǎn)與蕨麻正丁醇部位相同。在表達(dá)降低的39個(gè)點(diǎn)中，能被三個(gè)劑量組及復(fù)方丹參組共同上調(diào)的有4個(gè)點(diǎn)。
　　 3.差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定
　　 對(duì)取得的7個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，得分

7、均大于61分（P<0.05），可以確認(rèn)蛋白質(zhì)種類。分別為αB晶體蛋白（alpha B-crystallin）、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP）、輔酶Q10（NADH dehydrogenase1 alpha10）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）、肌球蛋白輕鏈3（myosin，light chain3）、肌球蛋白輕鏈2（Myosin

8、 regulatory light chain2），αB晶體蛋白CRA b亞基（crystallin.alpha B，isoform CRA b）
　　 4.Western blot驗(yàn)證
　　 Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，輔酶Q10在心肌細(xì)胞中存在表達(dá)，且該蛋白在心肌缺血再灌注損傷后以及藥物干預(yù)后表達(dá)的變化趨勢(shì)與雙向電泳圖像經(jīng)PDQuest軟件分析后得到的蛋白質(zhì)變化趨勢(shì)相一致。
　　 結(jié)論：
　　

9、1.蕨麻正丁醇部位能夠改善急性心肌缺血再灌注所致的心肌組織形態(tài)的病理改變，保護(hù)心肌組織的超微結(jié)構(gòu)，其作用與其清除自由基的能力有關(guān)。
　　 2.心肌缺血再灌注損傷可引起心肌蛋白質(zhì)表達(dá)變化，其中部分差異蛋白可被藥物干預(yù)向?qū)φ战M的方向調(diào)節(jié)，提示組織中出現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)中部分可能為心肌損傷誘導(dǎo)的基因表達(dá)產(chǎn)物及藥物作用靶點(diǎn)。
　　 3.經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，蕨麻正丁醇部位能通過(guò)上調(diào)輔酶Q10蛋白，減少自由基的產(chǎn)生，減輕膜脂質(zhì)過(guò)氧化保護(hù)損傷，從而