人低溫離體灌注心臟心肌缺血損傷早期蛋白組學(xué)初步研究.pdf

1、世界衛(wèi)生組織推薦心肌缺血的診斷標(biāo)準(zhǔn)包括三個方面，病史與癥狀、心電圖(electrocardiogram，ECG)的表現(xiàn)和生化標(biāo)志物。但臨床上心肌缺血的表現(xiàn)往往是不典型的，多樣性的，許多隱匿癥狀難以察覺；ECG 記錄心臟的電生理活動，只能在心肌缺血發(fā)生的幾分鐘內(nèi)記錄，敏感性低，文獻(xiàn)報道ECG 診斷心肌缺血靈敏度低于50％。因此一種靈敏的、可靠的、能在心肌缺血損傷早期階段檢測出的特異性生物標(biāo)志物將有助于急性心肌缺血患者的早期診斷和及時治療。

2、
　　 近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，為探索心肌缺血早期診斷的生物標(biāo)志物提供了新的技術(shù)平臺。蛋白質(zhì)組學(xué)通過對正常個體及病理個體間的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析，找到某些“疾病特異性的蛋白質(zhì)分子”，從而為疾病的早期診斷提供分子標(biāo)志。
　　 目的：
　　 對人低溫離體灌注心臟缺血損傷早期進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，分析人低溫離體灌注心臟缺血早期蛋白質(zhì)的釋放情況，并對收集到的蛋白進(jìn)行生理學(xué)過程和功能的分析，為最終篩選到能臨床診斷心肌缺

3、血損傷早期的特異性生物標(biāo)志物打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 收集人離體心臟停跳后30min和60min后的低溫灌注停跳液，首先用MARS 柱去除樣品中的高豐度蛋白，用10KD分子篩脫鹽濃縮、溶液內(nèi)酶解，得到肽段用MRP 柱再次脫鹽、凍干，通過HPLC-Chip-MS/MS 進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，運用Agilent 公司的SpectrumMill 專業(yè)統(tǒng)計分析處理軟件進(jìn)行IPI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索，通過GO 注釋和EBI 數(shù)據(jù)庫對得到

4、的蛋白進(jìn)行功能、定位分析和BLAST 比對。
　　 結(jié)果：
　　 1、鑒定到高可信蛋白176個（Score ≧8，SPI ≧70％）。包括MB、LDH、CK、CA、H-FABP、GOT，以及A1BG和Actin (肌動蛋白)、Ceruloplasmin (銅藍(lán)蛋白)和兩個未知蛋白106KD蛋白、29KD蛋白。
　　 2、高可信蛋白中有87個蛋白參與了細(xì)胞過程，包括線粒體、細(xì)胞骨架、細(xì)胞器等組織；74個蛋白參與了生

5、物學(xué)調(diào)節(jié)，包括生物和代謝過程的調(diào)節(jié)以及基因表達(dá)調(diào)節(jié)；71個蛋白參與代謝過程，包括分解代謝過程和生物合成代謝過程，以及蛋白修飾過程等；
　　 44個參與了對刺激的反應(yīng)，包括應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答等；34個參與了定位確立，包括離子轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運等；31個蛋白參與了發(fā)育過程，包括細(xì)胞分化和細(xì)胞發(fā)育過程等；
　　 其它的包括生物學(xué)粘附、多細(xì)胞生物過程等生理學(xué)過程。在功能方面，98個蛋白具有結(jié)合功能，47個蛋白具有催化活性，20個蛋

6、白具有酶調(diào)節(jié)活性，其它功能有結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運活性、轉(zhuǎn)錄活性及抗氧化活性等。
　　 3、鑒定到106KD蛋白序列長度為1703AA，與unc-13蛋白序列同源性達(dá)到100％；
　　 29KD蛋白序列長度276AA，與LOC339524蛋白同源性達(dá)到99％，局部對比發(fā)現(xiàn)該序列117 位置出現(xiàn)空位。
　　 結(jié)論：
　　 1、檢測到高可信蛋白176個，通過生理學(xué)過程和功能的分析，對心臟缺血早期發(fā)生過程中蛋白質(zhì)的

7、釋放情況有了進(jìn)一步的認(rèn)識，為最終篩選到能臨床診斷心肌缺血損傷早期的特異性生物標(biāo)志物打下了基礎(chǔ)。
　　 2、高可信蛋白中沒有cTn，表明低溫離體灌注心臟1h內(nèi)沒有出現(xiàn)心肌壞死，保證了心肌缺血損傷早期的實驗過程。
　　 3、A1BG、Actin、Ceruloplasmin 急性期反應(yīng)蛋白在心肌缺血1h內(nèi)出現(xiàn)，但未發(fā)現(xiàn)CRP、TNF-α、IL-6等炎癥因子，由于急性期反應(yīng)蛋白與C 反應(yīng)蛋白等炎癥因子密切相關(guān)，我們考慮在心肌缺血

8、損傷早期炎癥標(biāo)志物是繼發(fā)于急性期反應(yīng)蛋白后出現(xiàn)，但其確切關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。
　　 4、本研究檢測到的Actin、Ceruloplasmin、C6與趙慧輝等應(yīng)用高解析離子淌度質(zhì)譜與納升級超高效液相色譜技術(shù)尋找冠心病不穩(wěn)定心絞痛氣虛血瘀證的生物標(biāo)志物相一致。
　　 5、檢測到兩個未知蛋白，106KD和29KD蛋白。106KD蛋白序列同源性屬于unc-13蛋白家族，初步推測106KD蛋白是一種出胞作用的蛋白，29KD蛋白是一