蘿卜低溫弱光脅迫響應的蛋白組學與基因差異表達研究.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L.)又名蘆菔、萊菔，是起源于我國的一種重要十字花科根菜類蔬菜。由于其栽培面積大、營養(yǎng)價值高，在我國的蔬菜生產(chǎn)供應中居于重要的地位。低溫脅迫是決定作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要限制因子，太陽光是光合作用的能量來源，是植物生存的基礎，植物的光合作用依賴光。低溫弱光脅迫嚴重影響著蔬菜作物的生長，已經(jīng)成為限制蔬菜類產(chǎn)量的重要因素。
　　 低溫弱光脅迫，作為主要的非生物脅迫，嚴重影響著植物生長發(fā)育、地理分布

2、以及農(nóng)作物的產(chǎn)量。蛋白質(zhì)組學在后基因組時代發(fā)揮著越來越重要的作用，雙向電泳(2-DE)技術作為蛋白質(zhì)組學的支撐之一，被應用于生物學研究的許多領域。蘿卜喜溫性作物，特別是在冬春季保護地生產(chǎn)中低溫弱光成為限制蘿卜產(chǎn)量品質(zhì)的重要因子，目前有關蘿卜響應低溫弱光脅迫機理的研究鮮有報道。本研究以蘿卜高代自交系‘NAU-JLQX’為材料，比較兩種葉片蛋白質(zhì)提取方法，以獲得適合蘿卜葉片蛋白質(zhì)提取的方法;利用雙向電泳技術，分離低溫弱光脅迫前后蘿卜葉片差異

3、表達的蛋白，并對其進行質(zhì)譜鑒定與功能分析，并對相應基因進行RNA水平上的表達特性分析;利用mRNA差異顯示技術，進行低溫弱光下蘿卜葉片差異表達基因的分離鑒定，對部分低溫弱光脅迫響應基因進行了克隆與轉(zhuǎn)錄水平的表達分析;利用同源克隆技術克隆蘿卜低溫調(diào)控的相關基因，并進行低溫脅迫下的基因表達分析，從而為解析植物響應低溫弱光脅迫的分子遺傳機制提供理論依據(jù)。主要研究結果如下:
　　 采用Tris-HCl-TCA/丙酮沉淀法和改進的PEG分

4、級沉淀法提取蛋白質(zhì)，通過雙向凝膠電泳比較兩種蛋白質(zhì)提取方法的效果。結果表明，以pH4-7的17cm線性IPG膠條進行IEF，上樣量1000μg/350μl，蛋白質(zhì)可以得到較好的分離，2-DE凝膠圖譜質(zhì)量最佳;改進的PEG分級沉降法提取的葉片總蛋白質(zhì)，所提取三個組分的2-DE凝膠圖譜可清晰識別的蛋白質(zhì)點數(shù)目分別為537、170以及852，而Tris-HCl/TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)2-DE凝膠圖譜可識別出640個蛋白質(zhì)點。
　

5、　 采用蛋白質(zhì)雙向電泳技術，進行蘿卜葉片響應低溫(LT，5℃/2℃)弱光(WE，100μmol m-2 s-1)脅迫(分別處理0h，24 h以及96h)的差異蛋白質(zhì)組學研究。共鑒定19個蛋白點，發(fā)現(xiàn)鑒定的蛋白點主要參與了碳的新陳代謝(OEE2，RuBisCO大亞基，RuBisCO小亞基以及CA)，信號轉(zhuǎn)導(NDPK2)，蛋白質(zhì)合成(60S核糖體蛋白)，以及植物防御系統(tǒng)(CP)。對其中10個差異表達的蛋白點相應的基因進行半定量RT-PC

6、R分析，結果表明在mRNA水平上與蛋白質(zhì)水平的表達特性相一致。
　　 采用mRNA差異顯示(DDRT-PCR)技術，分離蘿卜‘NAU-JLQX’低溫弱光(100μmol m-2 s-1)脅迫前后差異表達的基因。總共克隆得到32條差異片段，其中17條與已知功能基因有較高的同源性。有2個是轉(zhuǎn)錄因子，2個參與光合作用，4個參與防衛(wèi)與脅迫響應，1個參與轉(zhuǎn)運過程，5個參與蛋白結合，1個為蛋白激酶以及1個參與表達調(diào)控。這些結果都表明低溫弱光

7、脅迫是一個復雜的過程，在這一過程中，許多生理生化過程都受到影響。
　　 根據(jù)不同作物抗冷相關基因保守域設計特異引物，以蘿卜(')NAU-YH’為材料進行PCR擴增，結果得到了四個冷馴化相關基因DNA及cDNA序列，分別命名為Rs-COR14，Rs-MYB4以及Rs-LOS2。分析其核苷酸序列表明，它們分別與擬南芥COR14，MYB4，以及LOS2具有較高的同源性。半定量RT-PCR結果表明，低溫弱光脅迫開始后，在對照中不表達的R