Hsc70蛋白：抗HBV耐藥的理論與實踐.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染可引起急性和慢性乙型肝炎，是導(dǎo)致肝硬化、肝癌等嚴重肝臟疾患的最主要原因之一。治療慢性乙肝的關(guān)鍵是抑制HBVDNA的復(fù)制，以減少肝臟并發(fā)癥的出現(xiàn)。過去十幾年，核苷類似物的出現(xiàn)使乙肝的治療有了重要的進展，然而長期用藥引起耐藥性病毒變異株的出現(xiàn)限制了它們的臨床效果。因此，發(fā)現(xiàn)新機制的抗乙肝藥物一直是我國藥物研究的重點之一。
　　 美國FDA(食品藥品管理局，F(xiàn)oodand

2、Drug Admistraton)批準的抗HBV核苷類藥物主要作用于HBVDNA聚合酶，長期應(yīng)用誘導(dǎo)其發(fā)生耐藥性突變。而病毒的復(fù)制過程需宿主細胞蛋白的幫助，因此尋找病毒所必需，而宿主細胞生存非必需的蛋白有可能成為發(fā)現(xiàn)抗HBV藥物的新靶點。以往研究表明分子伴侶熱休克蛋白Heatshockcognate70(Hsc70，HspA8)可能是HBV復(fù)制的一個重要輔助蛋白，我們認為該蛋白有可能成為HBV多聚酶之外的一個抗HBV的新藥物靶點。

3、>　　 為了證明這個結(jié)果，我們設(shè)計了以下實驗。將外源性Hsc70導(dǎo)入穩(wěn)定表達HBV的2215細胞，使Hsc70基因高表達。結(jié)果使細胞內(nèi)HBV復(fù)制增加了1.8倍；將特異性Hsc70siRNA轉(zhuǎn)染2215細胞，HBV復(fù)制顯著降低，并且沒有細胞毒性。以上結(jié)果表明，宿主Hsc70是HBV復(fù)制所必需的一個蛋白，而對宿主細胞的生長并不是必需的因素。
　　 通過篩選，我們首次發(fā)現(xiàn)我國天然化合物苦參素(Oxymatrine，OMTR；MW:2

4、64.31)能特異性下調(diào)肝細胞Hsc70的表達，在體內(nèi)外均具有明確的抗HBV療效，并且不影響HBV多聚酶的活性，也基本沒有細胞毒性。OMTR是從中藥苦豆子和苦參等中藥中提取出來的一種生物堿，是具有明確化學結(jié)構(gòu)的天然化合物，有多種藥理作用。OMTR在我國已經(jīng)有十幾年的臨床應(yīng)用歷史，主要用于抗肝炎的治療，其療效和安全性均得到普遍認可，但作用機理一直不清楚。上述研究為闡明OMTR的分子機理提供了重要的線索。
　　 我們進一步的研究表明

5、，OMTR能使細胞中Hsc70mRNA的降解速度明顯加快，使其半衰期(T1/2)縮短一半以上，說明OMTR主要在轉(zhuǎn)錄后水平通過降低Hsc70mRNA的穩(wěn)定性來下調(diào)其表達。
　　 OMTR降低Hsc70mRNA穩(wěn)定性的機制與mRNA的3'UTR結(jié)構(gòu)有關(guān)。我們將Hsc705'UTR及3'UTR全長分別插入到pLuc中Luc報告基因的上下游的5’端和3’端形成重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染肝細胞后用OMTR處理，再分析含有Hsc703'

6、U'rR或5'UTR的肝細胞內(nèi)LucmRNA的水平。結(jié)果顯示插入3'UTR后細胞內(nèi)LucmRNA的基礎(chǔ)表達水平明顯下降，而5'UTR則對LucmRNA無影響。這說明Hsc70mRNA3'UTR是OMTR的反應(yīng)元件。
　　 OMTR可以有效地抑制臨床野生株和變異株HBVDNA復(fù)制中間體的形成，從而抑制HBV復(fù)制，而對HBVRNA沒有影響，由此我們得出了OMTR抗HBV的分子機理全圖。
　　 由于OMTR通過作用于宿主降低H

7、sc70的表達水平來抑制HBV復(fù)制，我們推測這種作用機制的藥物不易引起HBV耐藥。我們分別用OMTR，3TC(Lamivudine，拉米夫定)及OMTR和3TC的聯(lián)合同時作用于2215細胞，連續(xù)處理細胞8個月。結(jié)果顯示，OMTR持續(xù)抑制HBVDNA的水平，3TC單獨給藥在第3個月出現(xiàn)病毒反跳，而OMTR和3TC聯(lián)合給藥不僅使細胞中HBVDNA持續(xù)降低而且還防止了HBV耐藥的發(fā)生。
　　 與HIV治療藥物相比，尤其在聯(lián)合化療方面，

8、對于HBV并沒有一種理想的聯(lián)合治療方案，主要原因是由于核苷類似物抗HBV作用靶點的單一性。鑒于OMTR通過與核苷類似物不同的機理來抑制HBV復(fù)制，我們探索了OMTR、PFA(Foscarnetsodium，磷甲酸鈉)與ADV(AdefovirDipivoxil，阿德福韋酯)聯(lián)合進行抗HBV治療的可能性。我們用OMTR、PFA和ADV矩陣組合，處理2215細胞，7天后，結(jié)果顯示，與單獨給藥相比，劑量比例適當?shù)穆?lián)合給藥處理的細胞中HBVDN

9、A總量減少更為顯著，明顯優(yōu)于OMTR、PFA和ADV單獨給藥，為今后聯(lián)合化療提供了基礎(chǔ)。
　　 對于慢性乙型肝炎(CHB)患者的臨床研究表明，OMTR0.4g每天2次口服給藥治療12個月后，能使17例對3TC耐藥的CHB患者血清HBVDNA和HBeAg濃度分別下降96％和70％，效果與20例初次治療的CHB患者相當。所有患者在用OMTR治療后未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。反映肝功能指標的ALT、AST、γ-GT，與用藥前相比，顯著降低(A

10、LT，AST，γ-GT:p<0.001)，表明CHB患者肝功能明顯改善。臨床肝組織活檢的結(jié)果表明，OMTR在抑制肝臟組織HBV載量的同時也顯著降低了組織中Hsc70的表達水平，進一步在人體證實了OMTR通過宿主Hsc70抑制HBV復(fù)制的機制。
　　 在進一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)對于CHB患者，單用3TC治療12個月，發(fā)生耐藥的幾率為7/25；而用OMTR與3TC聯(lián)合治療12個月后發(fā)生耐藥的幾率僅為1/15(3TCvs3TC/OMT

11、R，p<0.01)。
　　 我們的該項研究包括了從分子水平到細胞水平，到臨床試驗等一系列工作。結(jié)果表明，細胞蛋白Hsc70在HBV復(fù)制中起重要作用，是一個新的抗HBV靶點；OMTR是一種安全可靠的具有新型機制的抗乙肝病毒的藥物，其作用機制與核苷類似物完全不同，它通過降低宿主Hsc70表達來抑制病毒復(fù)制；OMTR抗HBV的特點表現(xiàn)為不會對病毒產(chǎn)生化療壓力，因此可以避免誘導(dǎo)耐藥變異的發(fā)生。我們認為OMTR可單獨或與核苷類似物聯(lián)合應(yīng)用