NIRF蛋白與HBV核心蛋白的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：1.檢測NIRF蛋白和HBV核心蛋白在人正常肝組織和HBV感染的肝組織內(nèi)表達(dá)的相關(guān)性；檢測人正常肝組織和肝癌組織中NIRF基因的蛋白表達(dá)情況；2.構(gòu)建NIRF基因真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞HEK-293；3.構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)染能分泌HBV DNA的HepG2.2.15細(xì)胞，觀察NIRF蛋白與HBV核心蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。 方法：1.通過免疫組化方法檢測人正常肝組織（n=25）、HBV感染的肝組織（n=25）中NI

2、RF蛋白和HBV核心蛋白表達(dá)的相關(guān)性，并分析NIRF基因的蛋白表達(dá)是否有差異；通過免疫組化方法檢測人正常肝組織（n=25）、肝癌組織（n=25）中NIRF基因的蛋白表達(dá)情況；2.通過RT-PCR方法，從人肝癌組織中獲得NIRF基因，將其插入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，構(gòu)建成重組載體pIRES2-EGFP-NIRF，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選出含有正確插入片段的克隆，經(jīng)PCR、酶切及DNA測序鑒定；實(shí)驗(yàn)分三組：HEK-293-

3、NIRF組（利用脂質(zhì)體將構(gòu)建成功的重組載體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞）、HEK-293-Null組（空載體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞）、HEK-293組（未轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞）；采用PCR技術(shù)和Western blotting方法分別檢測三組中NIRF mRNA及蛋白水平的表達(dá)，成功建立細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型；3.構(gòu)建好的重組載體pIRES2-EGFP-NIRF轉(zhuǎn)染能分泌HBV DNA的HepG2.2.15細(xì)胞，通過免疫熒光檢測NIRF蛋白和HBV

4、核心蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。 結(jié)果：1.通過免疫組化法檢測蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NIRF蛋白含量與HBV核心蛋白（HBV-CP）含量呈正相關(guān)；人肝癌組織中NIRF蛋白表達(dá)明顯高于在人肝正常組織中的表達(dá)；2.利用酶切、PCR分析、DNA測序證實(shí)，重組載體即NIRF真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-NIRF構(gòu)建成功；經(jīng)PCR和Western blotting證實(shí)，人胚腎上皮細(xì)胞HEK-293中無NIRF的轉(zhuǎn)錄及翻譯，是進(jìn)行NIRF轉(zhuǎn)染的良好

5、細(xì)胞模型，重組載體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后，經(jīng)PCR和Western blotting證實(shí)轉(zhuǎn)染成功；3.重組載體pIRES2-EGFP-NIRF轉(zhuǎn)染能分泌HBV核心蛋白（HBV-CP）的HepG2.2.15細(xì)胞，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NIRF蛋白和HBV核心蛋白（HBV-CP）在細(xì)胞內(nèi)有共同的亞細(xì)胞定位。 結(jié)論：NIRF具有泛素化能力，HBV-CP的第7位和第96位Lys殘基具有被泛素化的分子基礎(chǔ)；在肝細(xì)胞內(nèi)NIRF的含量與HBV