附睪蛋白酶抑制蛋白與男性不育的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分 Eppin基因的克隆、表達(dá)、鑒定及純化 目的:表達(dá)、鑒定和純化重組的具有生物學(xué)活性的人類Eppin蛋白，為臨床不育癥患者的診斷和治療提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:用TRIzol RNA提取試劑盒提取人睪丸組織總RNA，PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的Eppin基因序列(GeneBank accession No.BC053369)，缺失N-端分泌調(diào)控序列，上游引物：5'-GG-GGATCC(BamHI)-ctcttag

2、cgaatgtccagggac-3’；下游引物：5'-GGG-CTCGAG(XhoI)-tcagggaaagcgtttattct-3’。RT-PCR產(chǎn)物連入pET-28a(+)載體，酶切鑒定，DNA測(cè)序確認(rèn)后陽性重組克隆命名為pET28a-His6-Eppin。同樣的方法獲得pCDNA-Eppin真核表達(dá)載體。表達(dá)載體pET28a-His6-Eppin轉(zhuǎn)化BL21(DE3)受體，挑單克隆菌LB培養(yǎng)液(卡那霉素50mg/L)37℃培養(yǎng)，O

3、D600 nm達(dá)到0.6～0.8，不同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，6000g 4℃離心20分鐘，誘導(dǎo)后菌體用PBS重懸，冰浴超聲破碎，分別收集上清和沉淀，12％的SDS.PAGE判斷目的蛋白表達(dá)水平。用His-SelectTM HC鎳柱純化重組蛋白His6-Eppin。具體操作為：50mL裂解緩沖液(50mM sodium phosphate，0.3M NaCl，pH 8.0)重懸菌體后，冰浴超聲破碎后，4℃，12，000g離心20分鐘，

4、上清過預(yù)先經(jīng)平衡緩沖液(50mM sodium phosphate，0.3M NaCl，10mM imidazole，pH 8.0)平衡的鎳親和柱，洗滌緩沖液(50mM sodium phosphate，0.3M NaCl，10～50 mM imidazole，pH 8.0)洗脫非特異性結(jié)合蛋白，重組蛋白用洗脫緩沖液(50mM sodium phosphate，0.3M NaCl，50～250mM imidazole，pH 8.0)洗脫

5、，收集后用20 mMTris-HCl，200 mM NaCI(pH8.0)緩沖液4℃透析過夜。考馬司亮蘭染色蛋白定量，12％的SDS.PAGE分析蛋白濃度和純度。6只8周齡雌性Balb/c小鼠購自上海SLAC公司，免疫程序?yàn)椋旱谝淮蚊庖撸?0μgHis6-Eppin的100 ul PBS加100μl佐劑皮下注射；兩周后進(jìn)行第二次免疫，含60 μg His6-Eppin的100 ul PBS加100μl佐劑皮下注射，8天后，小鼠眼眶采血

6、，測(cè)定血清效價(jià)。抗體純化參照蛋白A瓊脂糖凝膠親和層析柱使用說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，純化所得多克隆抗體加入50％的甘油于-20°C保存。純化的His6-Eppin包被ELISA板，小鼠血清倍比稀釋后加樣，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，TMB顯色，于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀數(shù)。提取人睪丸總蛋白，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移NC膜，以小鼠抗His6-Eppin多抗為一抗(1:500稀釋)，二抗為過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1:5，000

7、稀釋)。10μm人睪丸組織丙酮固定后制備冰凍切片，pCDNA-Eppin真核表達(dá)質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以小鼠抗His6-Eppin多抗為一抗(1:100)，Texas Red標(biāo)記的抗鼠IgG抗體為二抗(1010-07SouthernBiotech，USA)，熒光顯微鏡激發(fā)波長615nm下觀察，拍照。 結(jié)果:1、以人睪丸組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板PCR擴(kuò)增獲得360bp的Eppin片

8、段，亞克隆進(jìn)pET28a(+)，構(gòu)建pET28a-His6-Eppin，經(jīng)PCR鑒定及酶切片段大小確認(rèn)，測(cè)序表明讀碼框正確，BLAST比對(duì)與報(bào)道序列一致(GeneBank accession No.BC053369)，表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)。將Eppin DNA片段以同樣的方法亞克進(jìn)pCDNA3.1(+)，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCDNA-Eppin。 2、用lmM的IPTG于37℃、4

9、h誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)，在12％的SDS-PAGE上19KD處有一明顯的表達(dá)條帶，其分子量大小與融合蛋白His6-Eppin大小一致，但其主要在包涵體中。為得到可溶性的，具有生物活性的目的融合蛋白，我們降低了IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度，從SDS-PAGE和Quantity One軟件分析(Figure 2.A)可看出，IPTG濃度從1mM降至0.5mM時(shí)，可溶性的目的融合蛋白Ak8％升至18％；誘導(dǎo)溫度改為30℃時(shí)，可溶性蛋白所占比率變化不大，但當(dāng)

10、誘導(dǎo)溫度降至26℃時(shí)，可溶性目的蛋白比率可達(dá)到40％，為37℃誘導(dǎo)溫度下的5倍(Fig.2.B)。結(jié)果表明降低IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度可提高可溶性His6-Eppin的產(chǎn)量，因此我們選用0.5 mMIPTG于26℃大量誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)來制備重組融合蛋白。 3、用鎳親和層析柱對(duì)His6-Eppin融合蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE結(jié)果表明，從1L誘導(dǎo)細(xì)菌中最終得到約18.33mg的His6-Eppin融合蛋白。 4、ELISA檢

11、測(cè)His6-Eppin蛋白免疫后小鼠血清抗體滴度為1:2，并用蛋白A瓊脂糖凝膠親和層析柱進(jìn)行了純化。 5、Western-blot為檢測(cè)上述制備的多克隆抗體的特異性，將純化后的鼠源抗His6-Eppin多克隆抗體與人睪丸組織總蛋白雜交后結(jié)果顯示，在14kDa左右有一明顯條帶(與組織Eppin蛋白大小一致)，在12kDa左右處有一微弱條帶。 6、為進(jìn)一步證實(shí)多抗的特異性，用所得多抗進(jìn)行人睪丸組織切片免疫組化，熒光顯微鏡下觀

12、察可見，附睪組織大多數(shù)細(xì)胞胞漿和微絨毛有特異性紅色熒光。對(duì)照組切片以非特異性的小鼠IgG為一抗則未見熒光。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA-Eppin瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，固定后，以本實(shí)驗(yàn)純化多抗為一抗，細(xì)胞免疫熒光后顯示胞漿內(nèi)有特異性紅色熒光，而轉(zhuǎn)染pCDNA3.1的細(xì)胞(陰性對(duì)照組)中未見熒光。結(jié)果表明真核表達(dá)載體可成功表達(dá)Eppin蛋白，并且可被抗His6-Eppin多克隆抗體識(shí)別。

13、結(jié)論:我們使用pET-28a質(zhì)粒和鎳親和柱表達(dá)、純化的重組人類Eppin蛋白具有生物學(xué)活性，這將進(jìn)一步對(duì)臨床不育癥患者的診斷和治療以及為男性免疫性避孕疫苗的研究提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分抗精子抗體陽性的不育患者精液中抗Eppin抗體的檢測(cè)及意義 目的:本研究的目的是用重組的人類Eppin蛋白作為抗原，檢測(cè)抗精子抗體陽性的不育患者精液中的抗Eppin抗體的存在和水平，并探討抗精子抗體陽性的不育患者精液中抗Eppin抗體

14、檢測(cè)的臨床意義。 方法:25例不育患者的精液標(biāo)本來自男性不育癥門診，入選標(biāo)準(zhǔn)為：結(jié)婚2年以上、性生活正常、未采用任何避孕措施、經(jīng)男科檢查同時(shí)其配偶經(jīng)婦科檢查均排除器質(zhì)性疾病、精液抗精子抗體檢測(cè)陽性的不育男性患者。25例正常對(duì)照組的男性精液標(biāo)本取自自愿捐獻(xiàn)者，入選標(biāo)準(zhǔn)為：無免疫性疾病、有生育史、精液抗精子抗體檢測(cè)陰性的男性患者。其中抗精子抗體陽性組平均年齡(28.5 1±3.38)歲，正常對(duì)照組平均年齡(2 9.74±5.36)歲

15、。抗精子抗體陽性組既往有前列腺炎病史4例、附睪炎病史1例、非特異性尿道炎病史2例，正常對(duì)照組既往無泌尿生殖系統(tǒng)感染病史。精液標(biāo)本ELISA分析：用0.05M PH 9.6碳酸鹽包被緩沖液將純化的重組蛋白His6-Eppin稀釋至蛋白質(zhì)含量為10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板(Nunc，Roskilde，Denmark)的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗5次。加一定稀釋的待檢精液樣品于上述已包被之反應(yīng)孔中，

16、置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的(經(jīng)滴定后的稀釋度)HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值。精液標(biāo)本W(wǎng)estern blot分析：純化重組蛋白His6-Eppin樣品，加入RIPA緩沖液(50 mM Tris-HCl(pH 8.0)，

17、150 mM NaCl，0.1％SDS，1％NP40，1 mM phenylmethylsulfonylfluoride，5 μg/ml aprotinin，and 5 pg/ml leupeptin.)，稀釋的抗精子抗體陽性不育患者精液標(biāo)本作為一抗(1:500)，peroxidase conjugated羊抗人IgG(Sigma)作為二抗(1:5，000)，Odyssey掃描系統(tǒng)進(jìn)行分析與掃描。 結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在抗精子抗