LPAAT蛋白家族與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究.pdf

1、腫瘤轉(zhuǎn)移始終是腫瘤防治工作中面臨的難題，只有有效控制、阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移才可能實(shí)現(xiàn)腫瘤的治愈。腫瘤在演進(jìn)過程中，一些腫瘤細(xì)胞具有了侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而這種轉(zhuǎn)移表型的獲得在很大程度上是由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生異常改變引起的。目前，從分子水平揭示腫瘤轉(zhuǎn)移的本質(zhì)，研究腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因成為腫瘤轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)。
　　 溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（Lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT）是細(xì)胞內(nèi)參與磷脂生成及

2、代謝的酶類，能夠催化?；o酶A 上的?；D(zhuǎn)移到溶血磷脂酸（LPA）生成磷脂酸（PA），LPAAT蛋白家族目前已發(fā)現(xiàn)有8個(gè)成員，有研究發(fā)現(xiàn)，LPAAT在髓性白血病細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而且其表達(dá)水平與白血病細(xì)胞的異常增殖和耐藥性有關(guān)。還有研究表明LPAAT在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度及預(yù)后相關(guān)。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要以溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶家族成員—LPAAT-theta（又稱mag-1，metastasis ass

3、ociated gene-1）和LPAAT-beta作為研究對(duì)象，通過改變mag-1在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的變化情況，以及腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞對(duì)微環(huán)境適應(yīng)能力；通過改變LPAAT-beta在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，初步探討LPAAT-beta與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。為了解LPAAT蛋白家族在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的功能和分子機(jī)制提供依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 （1）mag-1與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究通過

4、小鼠體內(nèi)自發(fā)成瘤和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)確定mag-1與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。以shRNA敲低mag-1的表達(dá)，敲低實(shí)驗(yàn)組小白鼠乳腺生成原發(fā)瘤的平均重量為2.065±0.241g，而空白組與無關(guān)干涉組小鼠乳腺生成的原發(fā)瘤的平均重量分別為3.998±0.597g和3.268±0.638g。敲低實(shí)驗(yàn)組小于空白組和無關(guān)干涉組；而且敲低實(shí)驗(yàn)組小白鼠肺部生成腫瘤轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)平均為0.889±0.269個(gè)，而空白組與無關(guān)干涉組小鼠肺部生成的轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)平均分別為7.182

5、±1.146個(gè)和9.143±1.033個(gè)。
　　 敲低實(shí)驗(yàn)組的數(shù)量明顯少于空白組和無關(guān)干涉組。說明干涉mag-1的表達(dá)不僅能夠抑制原發(fā)瘤的生長，而且還能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。
　　 （2） mag-1對(duì)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移微環(huán)境的適應(yīng)研究增強(qiáng)HIF-1a蛋白穩(wěn)定性的研究。上調(diào)mag-1的表達(dá)能夠增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1a 蛋白的表達(dá)；反之，下調(diào)mag-1的表達(dá)能夠減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1a蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，mag

6、-1過表達(dá)能夠增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1a蛋白的穩(wěn)定性，延長HIF-1a蛋白的半衰期，從而增加了腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1a蛋白的積累量。
　　 在mag-1 對(duì)HIF-1a下游靶基因的調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，mag-1 過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組H1299細(xì)胞中HIF-1a基因活性為0.612±0.014，空載組H1299細(xì)胞中HIF-1a基因活性為0.434±0.010；在氧氣濃度為0.5％的低氧條件下，mag-1過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組H1299細(xì)胞中HIF-1a基

7、因活性為1.139±0.092，空載組H1299細(xì)胞中HIF-1a基因活性為0.985±0.044；而且在正常細(xì)胞（猴腎成纖維細(xì)胞cos7）內(nèi)同樣能夠增加HIF-1a蛋白基因的活性；同時(shí)檢測(cè)HIF-1a蛋白下游靶基因發(fā)現(xiàn)，mag-1過表達(dá)上調(diào)了VEGF、Glut-1等基因的表達(dá)水平。說明mag-1能夠增強(qiáng)HIF-1a的基因活性，激活HIF-1a下游靶基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)能力。
　　 （3） LPAAT家族成

8、員LPAAT-beta與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究。
　　 通過檢測(cè)LPAAT-beta在多種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)可知，LPAAT-beta在多種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)存在差異，其中在HELF、PLA801C細(xì)胞系中的表達(dá)水平較低，在HeLa、A549細(xì)胞系中較高。之后，利用人胚肺成纖維細(xì)胞HELF進(jìn)行了轉(zhuǎn)染LPAAT-beta與mag-1單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選鑒定。獲得了LPAAT-beta相對(duì)高表達(dá)單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株C7、C3、F4，以及

9、mag-1相對(duì)高表達(dá)單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株D9、D6、D4。在此基礎(chǔ)上，利用體外細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了細(xì)胞增殖能力變化，穩(wěn)定過表達(dá)LPAAT-beta和mag-1的實(shí)驗(yàn)組OD值分別為0.435和0.408，與這兩組相比，空白組和空載組細(xì)胞在培養(yǎng)到第6天所測(cè)到的OD值分別為0.183和0.188。LPAAT-beta與mag-1 過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組的增殖能力高于空白組和空載組。
　　 而且，與空白組和空載組相比，LPAAT-beta與mag-1