蛞蝓多糖的提取及其抗HBV作用研究.pdf

1、目的：探討蛞蝓多糖的最佳提取條件，觀察蛞蝓多糖（Limax polysaccharide）體內(nèi)外抗乙型肝炎病毒（HBV）的效果，為臨床開發(fā)新的抗病毒藥物提供理論依據(jù)。 方法：蛞蝓，當?shù)匾巴獠杉?，鑒定。采用水提法提取蛞蝓多糖，以多糖含量為指標，從醇沉濃度、浸提溫度、浸提比和浸提時間4個因素進行正交優(yōu)選試驗。根據(jù)優(yōu)選工藝提取出的粗多糖經(jīng)Sevag法除蛋白、活性炭脫色，透析法除小分子物質(zhì)后得蛞蝓多糖純品，采用苯酚-硫酸比色法測定多糖含

2、量以備用。以HepG2（HBV-DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細胞）的2．2．15細胞株為模型，拉米呋啶為陽性對照，研究蛞蝓多糖體外抗HBV活性。在細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的蛞蝓多糖溶液進行混合培養(yǎng)，通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色分析法檢測藥物的細胞毒性，9d后用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中的HBsAg和HBeAg分泌水平，用實時熒光定量PCR技術檢測培養(yǎng)液中的HBV-DNA含量，作為藥物抗HBV的觀察指標，并與抗HBV藥物拉米呋啶進行對照研究

3、，對蛞蝓多糖體外抗HBV作用進行評價；體內(nèi)實驗采用先天感染鴨乙肝模型，分設生理鹽水模型對照組、拉米呋啶組、蛞蝓多糖低、中、高3個劑量組，每組8只雛鴨均以20mg/（kg·d）灌胃給藥10d。斑點雜交法觀察用藥前與用藥后5d、10d及停藥后5d血清中DHBV-DNA表達，對蛞蝓多糖體內(nèi)抗HBV的作用進行評價。 結果：正交實驗優(yōu)選出的蛞蝓多糖最佳提取工藝為醇沉濃度70％，浸提溫度60℃，浸提比1：2，浸提時間4h。體外實驗表明：蛞蝓

4、多糖在1mg/ml濃度以下對細胞無毒性；蛞蝓多糖在所稀釋的各濃度下，對HBsAg、HBeAg均有抑制作用，最大抑制率分別為56．2％和58．1％； HBsAg、HBeAg的治療指數(shù)分別大于19．98％、22．78％。蛞蝓多糖可抑制HBV-DNA的復制（P<0．05）。體內(nèi)實驗表明蛞蝓多糖不同劑量組對DHBV均有一定地抑制作用。其中蛞蝓多糖的中、高劑量組于用藥后第Sd血清DHBV-DNA的A490值為0．66±0．14、0．73±0．26

5、，第10d為0．47±0．18，0．54±0．10與生理鹽水對照組1．61±0．54、1．20±0．51比較明顯降低。蛞蝓多糖的中、高劑量組對DHBV-DNA的抑制率于用藥后第5d為24．14％、23．96％，第10d為45．98％、43．75％，與生理鹽水對照組相比明顯提高。 結論：優(yōu)選的蛞蝓多糖水提醇沉工藝經(jīng)濟，穩(wěn)定，可行。蛞蝓多糖在體內(nèi)、外均具有抗乙肝病毒作用。本研究為進一步深入研究多糖類藥物的生物學活性提供了實驗依據(jù)，亦