雙孢蘑菇多糖的提取分離及其免疫調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是一種常見的食用真菌，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖等多種成分，具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等?，F(xiàn)代研究表明，多糖在雙孢蘑菇發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性方面具重要意義，但其作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。本論文綜合采用多種色譜技術(shù)制備雙孢蘑菇多糖，并結(jié)合多種分析手段對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，以小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7為細(xì)胞模型，通過(guò)考察RAW264.7細(xì)胞的增殖、NO釋放、COX蛋白表達(dá)、炎癥相

2、關(guān)因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的表達(dá)以及相關(guān)蛋白水平的調(diào)控，探究雙孢蘑菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)作用機(jī)制，以期為雙孢蘑菇多糖的開發(fā)利用提供新的理論依據(jù)。主要研究成果如下：
　　（1）微波輔助熱水浸提法提取雙孢蘑菇粗多糖，并通過(guò)AB-8大孔吸附樹脂脫色素，D201離子交換樹脂脫蛋白質(zhì)，SephacrylTM S-300凝膠柱層析獲得分子質(zhì)量均一的雙孢蘑菇多糖樣品。采用苯酚-硫酸法測(cè)得雙孢蘑菇多糖含量為99.2％（以葡萄

3、糖計(jì)）。采用排阻色譜法，利用葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)分子量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得雙孢蘑菇多糖的分子量為822KDa。
　?。?）HPLC柱前衍生化法測(cè)得該多糖的主要單糖組成為甘露糖（含量28.26%）、葡萄糖（含量20.88%）、半乳糖（含量27.82%）和少量木糖（含量9.87%）。紅外光譜顯示雙孢蘑菇多糖具有多種多糖的特征吸收峰，1035.82 cm-1和886.57c m-1特征吸收峰顯示該多糖主要為β-吡喃型多糖。核磁共振

4、波譜（1H-NMR）顯示該多糖主要由β-吡喃糖組成，并含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖各單糖殘基的特征吸收峰，這與紅外光譜分析和單糖組成分析結(jié)果一致。
　?。?）MTT試驗(yàn)表明，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細(xì)胞12 h后，低濃度（1μg·mL-1）的雙孢蘑菇多糖可以顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，高濃度（10μg·mL-1）的雙孢蘑菇多糖能夠顯著抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖?？傮w而言，當(dāng)濃度逐漸升高時(shí)雙孢蘑菇多糖對(duì)RA

5、W264.7細(xì)胞的增殖作用呈現(xiàn)出由促進(jìn)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐种频内厔?shì)。
　　（4）Griess試驗(yàn)和Western Blot試驗(yàn)表明，不同濃度的雙孢蘑菇多糖作用RAW264.7細(xì)胞12 h后，1μg·mL-1、5μg·mL-1和10μg·mL-1該多糖可以顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中NO釋放和壓力反應(yīng)蛋白（iNOS和COX-2）表達(dá)量的增加，且具有一定的劑量依賴性，初步表明該多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。RT-PCR試驗(yàn)和瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)

6、顯示，不同濃度的雙孢蘑菇多糖作用RAW264.7細(xì)胞12 h后，1μg·mL-1、5μg·mL-1和10μg·mL-1的該多糖均能夠顯著促進(jìn)IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2 mRNA的表達(dá)（relative toβ-actin），且具有一定的劑量依賴性，進(jìn)一步說(shuō)明了雙孢蘑菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。另外，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細(xì)胞后，能夠顯著促進(jìn)IκB-α和ERK蛋白的磷酸化水平，激活I(lǐng)κB/NF-κB和ERK/MAP

7、K;通路，表明該多糖能夠通過(guò)激活 RAW264.7細(xì)胞中的IκB/NF-κB信號(hào)通路和ERK/MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，從而起到相應(yīng)免疫調(diào)節(jié)作用。
　?。?）Western Blot試驗(yàn)顯示，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細(xì)胞12 h后，1μg·mL-1、5μg·mL-1和10μg·mL-1雙孢蘑菇多糖均能夠誘導(dǎo) RAW264.7細(xì)胞中caspase-3的激活，且隨著濃度的增加，Cleaved caspase-3的表

8、達(dá)量增加，具有一定的劑量依賴性，表明雙孢蘑菇多糖可以誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的凋亡作用。同時(shí)，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細(xì)胞后，能夠在15-90 min內(nèi)顯著誘導(dǎo)JNK蛋白的磷酸化，從而激活JNK/MAPK信號(hào)通路。另外，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細(xì)胞12 h后，5μg·mL-1和10μg·mL-1雙孢蘑菇多糖能夠顯著抑制RAW264.7細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)；1μg·mL-1、5μg·mL-1和10μg·mL-1雙

9、孢蘑菇多糖能夠顯著促進(jìn)Bim蛋白的表達(dá)，且Bim蛋白的表達(dá)主要是由JNK/MAPK通路的激活誘導(dǎo)產(chǎn)生。上述結(jié)果表明，雙孢蘑菇多糖能夠通過(guò)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中JNK/MAPK通路的激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，且主要是經(jīng)過(guò)Bc l-2和B im蛋白的共同介導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。
　　綜上所述，雙孢蘑菇多糖具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性，可以作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑，具有較為廣闊的開發(fā)前景。雙孢蘑菇多糖在促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的