安絡(luò)小皮傘多糖的提取及其免疫調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、中醫(yī)對(duì)菌類本草的認(rèn)識(shí)，是依據(jù)中醫(yī)藥的理論體系來(lái)闡述的，由于菌類本草具有獨(dú)特的調(diào)理先天之本“腎”和后天之本“脾”的作用，所以受到了不少中醫(yī)藥學(xué)者的重視與運(yùn)用。菌類本草中不少藥物具有“扶正補(bǔ)虛”的作用，可廣泛運(yùn)用于精神不振、身倦體乏、咳嗽咳血、氣短自汗、畏寒肢冷、久病虛贏、舌淡、脈沉細(xì)無(wú)力等氣虛、陽(yáng)虛、血虛、陰虛、陰陽(yáng)俱虛的患者。安絡(luò)小皮傘是一種分布于我國(guó)吉林、遼寧等地的擔(dān)子菌綱真菌，是一種長(zhǎng)期被民間食用和藥用的菌類本草。本研究以安絡(luò)小皮傘

2、多糖(Marasmiusandrosaceuspolysaccharide，MAP)粗品為原料，進(jìn)行免疫活性多糖的提取、純化并對(duì)分離純化得到的各個(gè)安絡(luò)小皮傘多糖組分進(jìn)行了免疫活性評(píng)價(jià)，篩選出具有明顯免疫活性的安絡(luò)小皮傘多糖組分MAP60，在此基礎(chǔ)上，就MAP60對(duì)免疫抑制小鼠非特異性免疫、特異性免疫功能的影響進(jìn)行了研究，并采用分子生物學(xué)技術(shù)手段研究其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。 1.安絡(luò)小皮傘多糖的提取工藝研究 目的：安絡(luò)小皮傘多

3、糖最佳提取條件的確定。 方法：相關(guān)研究表明，影響多糖提取率的主要因素有乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間等。為確定安絡(luò)小皮傘水溶性多糖的最佳提取條件，本實(shí)驗(yàn)首先采用乙醇濃度為60％～100％，水提溫度為50℃～90℃，水提時(shí)間為1h～5h，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定提取條件范圍。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將醇沉濃度、水提溫度、水提時(shí)間三項(xiàng)作為考察因素，進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定最佳提取條件。對(duì)提取到的粗多糖繼續(xù)進(jìn)行純化，再對(duì)純化后多糖進(jìn)行乙醇分級(jí)，得

4、到3個(gè)安絡(luò)小皮傘多糖組分：MAP40、MAP60、MAP80。 結(jié)果：通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，確定了安絡(luò)小皮傘多糖的最佳提取條件：醇沉濃度為90％、水提溫度為80℃、水提時(shí)間為5h。 結(jié)論：當(dāng)采取最佳的提取條件提取安絡(luò)小皮傘多糖時(shí)，此時(shí)安絡(luò)小皮傘多糖得率最高，可以達(dá)到51.44％。 2.安絡(luò)小皮傘多糖免疫活性組分的篩選 目的：對(duì)安絡(luò)小皮傘多糖中具有免疫調(diào)節(jié)作用的組分進(jìn)行篩選。 方法：對(duì)MAP4

5、0、MAP60、MAP80組分進(jìn)行體外免疫活性測(cè)定，分別檢測(cè)其對(duì)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞增殖能力的影響。 結(jié)果：MAP40對(duì)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞增殖作用不明顯，MAP60、MAP80均具有協(xié)同有絲分裂原促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖并提高腹腔巨噬細(xì)胞增殖的功能。 結(jié)論：MAP60、MAP80是MAP的免疫活性組分。考慮到提取成本及多糖含量等因素，選取MAP60組分繼續(xù)深入研究其免疫活性。 3.MA

6、P60免疫活性研究 目的：檢測(cè)MAP60的免疫活性。 方法：采取皮下注射環(huán)磷酰胺的方法誘導(dǎo)免疫抑制模型。用非特異性免疫及體液免疫、細(xì)胞免疫的相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)MAP60對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫功能低下小鼠免疫功能的影響。 結(jié)果：皮下注射環(huán)磷酰胺后，小鼠的非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有所抑制。免疫抑制小鼠腹腔注射MAP60后，MAP60可以增強(qiáng)免疫抑制小鼠非特異性免疫功能如提高吞噬細(xì)胞的吞噬功能、提高免疫抑制小鼠

7、脾指數(shù)、提高免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞水平；增強(qiáng)免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能如提高遲發(fā)超敏反應(yīng)能力和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；增強(qiáng)免疫抑制小鼠的體液免疫功能如提高抗體分泌水平。 結(jié)論：MAP60可以提高免疫抑制小鼠的非特異性免疫、細(xì)胞免疫、體液免疫功能，能有效拮抗環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫功能的抑制作用。 4.MAP60免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制的探討 目的：從分子和基因水平分析MAP60的作用機(jī)制。 方法：采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)免疫抑制小

8、鼠血清及淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1、IL-2、INF-α、IFN-γ的分泌水平進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)MAP60對(duì)免疫抑制小鼠脾細(xì)胞中IL-2mRNA、IFN-γmRNA和腹腔巨噬細(xì)胞中IL-1mRNA、INF-αmRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：MAP60可以提高IL-1、IL-2、INF-α、IFN-γ在外周血中和免疫細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的水平，提高腹腔巨噬細(xì)胞中IL-1mRNA、INF-αmRNA的表達(dá)，提高小鼠脾細(xì)胞中I