HBV與多重耐藥蛋白MDR1的相互作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是嚴(yán)重危害全人類公共健康的常見傳染病。但目前尚無(wú)治療方法能徹底清除慢性HBV感染；同時(shí)也缺乏對(duì)HBV發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究的、較好的體內(nèi)或體外模型。因此，直接從人肝組織樣本入手仍是現(xiàn)階段探索和認(rèn)識(shí)慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和治療方法的最佳途徑。我們擬通過(guò)本研究篩選出在CHB患者肝組織內(nèi)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)（differenti

2、ally expressed proteins,DEPs），并尋找到在闡明宿主-病毒相互作用機(jī)制方面發(fā)揮至關(guān)重要作用的新蛋白質(zhì)。進(jìn)一步深入研究目的差異蛋白在HBV轉(zhuǎn)錄、復(fù)制中的作用，以及HBV調(diào)控目的差異蛋白的可能分子機(jī)制。
　　方法：通過(guò)同位素標(biāo)簽的相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）耦合液相色譜-二維串聯(lián)質(zhì)譜分析（liquid c

3、hromatography and two dimensional tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）技術(shù)對(duì)CHB患者的肝穿刺組織和未感染 HBV人群的肝組織進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，從而鑒定出可能參與宿主-病毒相互作用的蛋白改變；并采用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative reverse transcription–polymerase chain reaction,qRT-PCR）和蛋

4、白免疫印跡（Western blot,WB）的方法對(duì)質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；最終確定擬于下一步深入研究的目的DEPs，進(jìn)而在多個(gè)體外細(xì)胞模型中確認(rèn)目的DEPs的表達(dá)。接下來(lái)，通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，將目的差異蛋白的siRNA轉(zhuǎn)入HepG2.2.15細(xì)胞，干擾其在HBV細(xì)胞中的表達(dá)；再采用qPCR、WB、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）等方法檢測(cè)HBV復(fù)制中間體及HBV相關(guān)標(biāo)

5、志物的表達(dá)變化情況，進(jìn)而明確目的差異蛋白在HBV轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過(guò)程中所發(fā)揮的作用。最后，采用分別轉(zhuǎn)染不同片段HBV質(zhì)粒的方法，尋找到對(duì)目的差異蛋白的表達(dá)起調(diào)控作用的病毒蛋白，并在CHB患者肝組織中通過(guò)免疫組化（Immunohistochemical analysis,IH）的方法驗(yàn)證病毒蛋白和目的差異蛋白之間的這種關(guān)系；再使用轉(zhuǎn)錄因子芯片的方法篩選出在該病毒蛋白和目的差異蛋白之間起中間作用的TF，并用qRT-PCR、WB的方法驗(yàn)證芯片結(jié)果；

6、進(jìn)而運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因、凝膠遷移電泳實(shí)驗(yàn)（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）等技術(shù)驗(yàn)證目的TF在這一過(guò)程中的作用。
　　結(jié)果：我們成功鑒定出1486個(gè)蛋白質(zhì)，篩選其中至少在12例CHB患者肝穿刺組織中表現(xiàn)出相同趨勢(shì)（表達(dá)同時(shí)上調(diào)或下調(diào)）的DEPs71個(gè)（53個(gè)在CHB患者肝穿刺組織中表達(dá)上調(diào)，另外18個(gè)則下調(diào)）。進(jìn)一步qRT-PCR和WB驗(yàn)證的結(jié)果與質(zhì)譜分析一致。在此基礎(chǔ)上，結(jié)

7、合Uniprot、PANTHER和Pubmed等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的綜合檢索結(jié)果，我們選擇了MDR1作為接下來(lái)深入研究的目的蛋白；并在HepG2、HepG2.2.15、Huh7和HepAD38等多個(gè)人肝癌細(xì)胞系中再次從mRNA、蛋白水平確認(rèn)了MDR1在HBV感染細(xì)胞株中的高表達(dá)（P＜0.05）。接下來(lái)，我們成功干擾了人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15中MDR1的表達(dá)（P＜0.05）。在轉(zhuǎn)染了ABCB1 siRNA的HepG2.2.15細(xì)胞中，3.

8、5kb mRNA的表達(dá)水平相對(duì)于轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA的HepG2.2.15細(xì)胞而言，顯著降低（P＜0.05）；而HBV復(fù)制中間體，以及包括HBsAg、HBeAg和HBcAg等在內(nèi)的HBV相關(guān)標(biāo)志物則沒(méi)有顯著改變（P＞0.05）。最后，我們發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)HBV大表面抗原（HBV large surface protein,LHBs）的人肝癌細(xì)胞株中，MDR1的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；CHB患者肝組織中 MDR1的表達(dá)量也與患者血清LHB

9、s濃度呈正相關(guān)（r2=0.76，P＜0.0001）。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄因子芯片篩選出缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia induced factor-1α,HIF-1α）可能是LHBs調(diào)節(jié)MDR1表達(dá)的中間TF；qRT-PCR、WB檢測(cè)也分別從mRNA、蛋白水平證實(shí)了芯片的結(jié)果。最后，我們采用雙熒光素酶報(bào)告基因、Electrophoretic mobility shift assay,EMSA的方法證實(shí)了HIF-1α確實(shí)是LHBs調(diào)控MDR1

10、表達(dá)的中間TF。
　　結(jié)論：相對(duì)于未感染HBV人群的肝組織而言，CHB患者肝穿刺組織中的MDR1高表達(dá)。并且在多個(gè)感染了HBV的人肝癌細(xì)胞系中，也發(fā)現(xiàn)MDR1的表達(dá)量相對(duì)于未感染的同源細(xì)胞株明顯增高。MDR1確實(shí)可以調(diào)節(jié) HBV轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的過(guò)程；并且MDR1對(duì) HBV轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的調(diào)控主要是通過(guò)對(duì)3.5kb mRNA的影響而實(shí)現(xiàn)的。而HBV對(duì)MDR1的調(diào)控是通過(guò)病毒蛋白LHBs對(duì)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的作用而實(shí)現(xiàn)的。提示MDR1可能是