基于與轉運蛋白P-gp相互作用的抗結核藥物耐藥機制研究.pdf

1、20世紀80年代后結核病疫情呈現(xiàn)全球性明顯回升趨勢，其主要原因之一是耐藥菌株的產(chǎn)生和播散，尤其是耐多藥菌株的出現(xiàn)。結核桿菌的高耐藥問題已成為新世紀結核病控制的難題之一。目前對耐多藥結核(MDR-TB)耐藥機制的研究主要集中在耐多藥分枝桿菌領域，較少從宿主角度考慮。結合抗腫瘤多藥耐藥機制的研究成果--即腫瘤多藥耐藥的發(fā)生主要是由于P-gp等轉運蛋白對藥物產(chǎn)生了外排作用。本課題通過分子生物學實驗和動物實驗兩部分研究，從宿主的角度考察了不同抗

2、結核藥物在體外對P-gp的影響，以及抗結核藥物不同組合在不同給藥周期條件下在體內(nèi)對藥物的組織分布和不同組織mdr1α mRNA表達水平的影響。
　　 目的：通過考察治療劑量的五種抗結核藥物利福平(RFP)、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰胺(PZA)和左氧氟沙星(LVX)對Caco-2細胞上P-gp功能和表達的影響，探討四種主要抗結核藥物與P-gp是否存在明顯相互作用；以此為基礎進一步選擇三種抗結核藥物研究不同組合對

3、藥物在昆明小鼠不同組織分布，以及對小鼠各組織mar1α mRNA表達水平的影響，初步探討宿主因素對抗結核藥物耐藥的影響，以及臨床抗結核治療標準給藥方案的潛在耐藥因素。
　　 方法：
　　 1.細胞模型的建立及細胞毒性試驗采用人結腸癌細胞(Caco-2)、臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV304)，為四種抗結核藥物對P-gp功能和表達的作用研究提供P-gp載體細胞和陰性對照細胞。ECV304和Caco-2細胞均采用MEM培養(yǎng)基進行常規(guī)

4、培養(yǎng)；細胞免疫熒光法進行細胞膜上P-gp表達驗證。
　　 采用苯基溴化四氮唑藍法(MTT)，判斷各試驗藥物的體外最大非細胞毒性劑量，保證試驗過程中細胞的活性，并為四種抗結核藥物對P-gp功能和表達的研究提供與細胞作用的安全濃度。
　　 2.羅丹明-123攝取實驗研究藥物對Caco-2細胞P-gp功能的影響以ECV304細胞作陰性對照細胞，采用流式細胞儀測定細胞內(nèi)熒光強度，以RFP作為P-gp功能誘導的陽性對照，維拉帕米(

5、VER)作為P-gp功能抑制的陽性對照，分別考察四種抗結核藥物對經(jīng)典P-gp功能探針藥物--羅丹明-123(Rh-123)攝取作用的影響，以此判斷P-gp功能的變化。
　　 3.流式細胞術檢測藥物對Caco-2細胞P-gp蛋白表達的影響以RFP作為P-gp表達上調(diào)的陽性對照，VER作為P-gp表達下調(diào)的陽性對照，不加藥處理的Caco-2細胞作為陰性對照，采用流式細胞術(FCM)分別分析四種抗結核藥物對Caco-2細胞上P-gp表

6、達的影響。
　　 4.實時熒光定量PCR檢測藥物對Caco-2細胞MDR1 mRSA表達以RFP作為MDR1 mRNA上調(diào)的陽性對照，VER作為MDR1mRNA下調(diào)的陽性對照，不加藥處理的Caco-2細胞作為陰性對照，采用實時熒光定量PCR技術分別分析四種抗結核藥物對Caco-2細胞MDR1 mRNA表達水平的影響。
　　 5.LC-MS/MS法測定昆明鼠血漿及各組織中三種抗結核藥物的濃度采用C4色譜柱(250mm×4.

7、6mm，5.0μm，Welch materials，USA)，流動相為0.05％甲酸溶液-甲醇(v/v)梯度洗脫，流速1.0mL·min-1，柱溫25℃，進樣量20μL，采用ESI+多反應選擇離子檢測(MRM)。
　　 6.三種抗結核藥不同給藥組合與不同給藥周期條件下在昆明鼠的血漿和組織分布情況昆明鼠168只，分為A組(空白組)、B組(INH alone組)、C組(RFP alone組)、D組(LVX alone組)、E組(IN

8、H+RFP組)、F組(LVX+RFP組)、G組(RFP+INH+LVX組)，每組24只，并隨機編號。腹腔注射給藥，每日1次，給藥體積為0.2ml，空白組給注射生理鹽水0.2ml，各藥物組給藥量分別為INH(45mg·kg-1)，RFP(67.5mg·kg-1)，LVX(45 mg·kg-1)。于第1次給藥后2小時，各組動物取一半，分別眼眶取血后處死小鼠，快速摘取腦、肝、腎、肺、小腸等組織，全血采用肝素抗凝，6000 r·min-1離心1

9、0min后分離血漿，編號后于-70℃冰箱保存待測，組織樣本經(jīng)生理鹽水洗凈后，稱重，裝于小封口袋，編號后于-70℃保存待測；于第10次給藥后2小時，分別處死各組剩余動物，分別采集上述樣本待測。通過測定血漿及各種組織中在給藥2h時的藥物濃度加以分析。
　　 7.三種抗結核藥不同給藥組合連續(xù)給藥10d對昆明鼠不同組織mdr1α mRNA表達水平的影響昆明鼠21只，體重30g左右。小鼠購回后均飼養(yǎng)3d適應新環(huán)境，按完全隨機設計分成7組，

10、每組3只。分組及給藥方法“同上”。在第10d給藥后2 h將小鼠放血處死，快速取出腦、肺、腎、小腸組織，編號后置于液氮中保存待測。各器官組織樣本進行RT-PCR檢測分析。
　　 結果：
　　 1.Caco-2細胞和ECV304細胞在正常條件下生長旺盛；Caco-2細胞P-gp高表達，可用于研究四種抗結核藥物對P-gp功能和表達的影響；ECV304細胞P-gp低表達，適合作為陰性對照細胞。MTT結果顯示五種抗結核藥及VER帶

11、藥培養(yǎng)3d，對Caco-2細胞的最大無毒濃度分別為：RFP100μmol/L，INH150μmol/L，LVX5μmol/L，EMB150μmol/L，PZA2001μmol/L，VER101μmol/L。在后續(xù)10d、20d、30d、40d、50d MTT實驗中選擇藥物的濃度分別為：RFP10μmol/L，INH80μmol/L，LVX2μmol/L，EMB301μmol/L，PZA100μmol/L(各藥物濃度均接近人常規(guī)劑量給藥后

12、的血藥峰濃度)；VER為10μmol/L。最終的MTT結果顯示：各細胞存活率均大于90％。因此，各藥物濃度適用于研究長期含藥培養(yǎng)對P-gp功能和表達的影響。
　　 2.各研究藥物對Caeo-2細胞P-gp功能的影響：藥物干預1h時，四個抗結核藥物組、陽性誘導對照組(RFP)及陽性抑制對照組(VER)均明顯減少了Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，揭示瞬時的藥物刺激能增強P-gp的外排功能，對干預藥物不具選擇性

13、。藥物干預3d時，四個抗結核藥物組、RFP組及VER組均明顯增加了Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，說明隨著短期內(nèi)藥物干預時間延長，藥物干預轉為減弱P-gp的外排功能，同樣對干預藥物不具選擇性。藥物干預10d時，四個抗結核藥物組、RFP組及VER組對P-gp的外排功能表現(xiàn)出差異，其中RFP、INH與EMB減少了Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，增強了P-gp的外排功能，表現(xiàn)出誘導作用；VER和

14、LVX增加了Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，減弱了P-gp的外排功能，表現(xiàn)為抑制作用；而PZA與陰性對照組比較無顯著性差異。藥物干預20d時，各藥物組與陽性對照組對Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的影響與干預10d時的結果趨勢一致。藥物干預30d時，各藥物組與陽性對照組對Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的影響與藥物干預10d和20d時的結果趨勢仍表現(xiàn)一致；其中VER和LVX仍表現(xiàn)為抑制作用(P<0.05)，但其增

15、加Caco-2細胞內(nèi)Rh-123蓄積的相對量有所下降；INH、EMB和RFP仍表現(xiàn)為誘導作用(P<0.05)。藥物干預40d時，四個抗結核藥物組、RFP組及VER組均明顯減少了Rh-123在Caco-2細胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，全部表現(xiàn)為誘導作用；且藥物干預50d時，各藥物組及陽性對照組與藥物干預40d時結果一致，也全部表現(xiàn)為誘導作用。
　　 3.各研究藥物對Caco-2細胞P-gp蛋白表達的影響：藥物干預1h時，四個抗結核

16、藥物組、陽性誘導對照組(RFP)及陽性抑制對照組(VER)分別與陰性對照組比較，P-gp的表達量差異均沒有統(tǒng)計學意義，說明瞬時(1h)的藥物干預對P-gp的表達量幾乎沒有影響；藥物干預3d時，四個抗結核藥物組、RFP組及VER組均下調(diào)了Caco-2細胞上P-gp的表達(P<0.05)，各組的P-gp表達量僅為陰性對照組的40％左右，說明短期(3d)的藥物干預，可較明顯的抑制P-gp的表達，且這一過程對干預藥物不具明顯的選擇性。藥物干預1

17、0d時，四個抗結核藥物組、RFP組及VER組對Caco-2細胞上P-gp的表達量表現(xiàn)出差異，其中INH組和EMB組的P-gp表達量與陽性誘導對照組(RFP)一致，約為陰性對照組的4～7倍，表現(xiàn)出誘導作用；LVX組與陽性抑制對照組(VER)一致，其P-gp表達量約為陰性對照組的30％，表現(xiàn)出抑制作用；而PZA與陰性對照組比較無顯著性差異。藥物干預20d時，各藥物組及陽性對照組對Caco-2細胞上P-gp表達量的影響與干預10d時的結果趨勢

18、一致，其中INH組租EMB組P-gp表達量約為陰性對照組的4倍，LVX組P-gp的表達量約為陰性對照組的50％，而PZA與陰性對照組比較無顯著性差異。藥物干預30d、40d、50d時，四個抗結核藥物組、RFP組及VER組均明顯增加了Caco-2細胞上P-gp的表達量(P<0.05)，表現(xiàn)出不具藥物選擇性的誘導作用。
　　 4.各研究藥物對Caco-2細胞MDR1 mRNA表達的影響：藥物干預1h時，四個抗結核藥物組、RFP組及V

19、ER組與陰性對照組比較，MDR1mRNA的表達量差異沒有統(tǒng)計學意義。藥物干預3d時，四個抗結核藥物組、RFP組及VER組均下調(diào)了Caco-2細胞上MDR1 mRNA的表達(P<0.05)，各組的MDR1 mRNA表達量僅為陰性對照組的30％左右。藥物干預10d時，INH、EMB及陽性誘導對照組RFP均上調(diào)了Caco-2細胞上MDR1 mRNA的表達(P<0.05)，其中INH、EMB的MDR1 mRNA的表達量為陰性對照組的12倍左右，

20、為陽性誘導組RFP的90％；LVX與陽性抑制對照組VER一致，下調(diào)了Caco-2細胞上MDR1 mRNA的表達(P<0.05)，其MDR1 mRNA表達量約為陰性對照組的30％；而PZA與陰性對照組比較無顯著性差異。藥物干預20d時，各藥物組及陽性對照組對Caco-2細胞上MDR1 mRNA表達量的影響與干預10d時的結果趨勢一致。藥物干預30d時，四個抗結核藥物組、RFP組及VER組均上調(diào)了Caco-2細胞上MDR1 mRNA的表達(

21、P<0.05)，表現(xiàn)出不具藥物選擇性的上調(diào)作用；且藥物干預40d和50d時，各藥物組與陽性對照組與干預30時結果趨勢一致，同樣表現(xiàn)出不具藥物選擇性的上調(diào)作用?？傮w上，各研究藥物在各時間周期對MDR1 mRNA表達的影響與對P-gp蛋白表達的影響趨勢基本一致。
　　 5.LC-MS/MS法測定昆明鼠血漿及不同組織中三種抗結核藥物的濃度：所建立的LC-MS/MS法專屬性強、靈敏準確，適用于同時測定血漿和組織樣本中INH、RFP和LV

22、X的濃度。
　　 6.三種抗結核藥不同給藥組合與不同給藥周期條件下在昆明鼠的血漿和組織分布結果：各給藥組在血漿中的藥物濃度均表現(xiàn)為連續(xù)給藥10d明顯比單次給藥高；而各給藥組在腦、肝、腎組織的藥物分布，表現(xiàn)為連續(xù)給藥10d藥物濃度均明顯低于單次給藥，并且LVX能明顯拮抗所合用藥物組織分布減少的趨勢。各給藥組在小腸組織的藥物分布，則表現(xiàn)為給藥10d藥物濃度與單次給藥無明顯差異。
　　 7.三種抗結核藥不同給藥組合連續(xù)給藥10

23、d對昆明鼠不同組織mdr1α mRNA表達水平的影響：對比空白組，同一藥物試驗組連續(xù)腹腔注射給藥10d后對小鼠不同組織mdr1α mRNA影響不同，而不同藥物試驗組對小鼠同一組織mdr1α mRNA的影響也不同；總體趨勢為INH組、RFP組、INH+RFP組均能明顯上調(diào)小鼠腦、腎和小腸組織的mdr1α mRNA水平，尤其是對腦組織和小腸組織中mdr1α mRNA水平的上調(diào)幅度達到5-70倍，對腎組織也達到8-12倍；而LVX則表現(xiàn)為下調(diào)

24、小鼠腦和腎組織的mdr1α mRNA水平，倍數(shù)為0.8-0.9，且LVX+RFP組較RFP組以及RFP+INH-LVX組較INH+RFP組對小鼠腦、腎和小腸組織的mdr1α mRNA水平上調(diào)程度均有顯著降低；但各藥物組對肺組織mdr1α mRNA水平均表現(xiàn)為下調(diào)趨勢，這可能與肺組織本身P-gp分布較少有關，肺組織僅在其分泌細胞有P-gp分布，而本實驗是測定的全肺組織，因此其整體mdr1α mRNA水平較低，藥物對其影響則不明顯。

25、　　 結論：
　　 1.體外細胞試驗初步證實INH和EMB為P-gp的誘導劑，INX為P-gp的抑制劑，PZA與P-gp無明顯的相互作用。并發(fā)現(xiàn)長期藥物干預時(>30d)，對Caco-2細胞上P-gp的功能和表達的影響表現(xiàn)出無藥物選擇性的上調(diào)作用，有待進一步證實。
　　 2.動物實驗發(fā)現(xiàn)，長期用藥(10d)過程中，不同藥物組合對藥物的組織分布以及組織mdr1α mRNA表達水平存在明顯影響，整體趨勢為上調(diào)組織mdr1α