CUL4A對(duì)乳腺癌細(xì)胞P-gp底物藥物多藥耐藥的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是世界范圍內(nèi)癌癥致死的主要原因之一，多藥耐藥(MDR)是其化療失敗的關(guān)鍵原因之一。在乳腺癌發(fā)病過(guò)程中，隨著MDR進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞開(kāi)始對(duì)一系列結(jié)構(gòu)不同、靶點(diǎn)不同的抗腫瘤的藥物都產(chǎn)生了抵抗作用，從而嚴(yán)重影響化療效果?；熯^(guò)程中引起MDR的原因有很多且機(jī)制復(fù)雜。人類(lèi)多藥耐藥基因1(MDR1)編碼一個(gè)位于細(xì)胞膜上的排出泵蛋白——P-糖蛋白(P-gp)。MDR1/P-gp過(guò)度表達(dá)使細(xì)胞膜上排出泵功能活躍，導(dǎo)致

2、腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療藥物抵抗。目前，對(duì)于這類(lèi)具有MDR現(xiàn)象的癌細(xì)胞，恢復(fù)其化療敏感性的措施十分有限。
　　CUL4A是一種新近發(fā)現(xiàn)的在乳腺癌中過(guò)度表達(dá)的癌基因，編碼E3泛素連接酶復(fù)合體的一個(gè)核心蛋白。這個(gè)復(fù)合體通過(guò)泛素化修飾和降解多種靶蛋白，調(diào)節(jié)多種重要的生理活動(dòng)，如細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)和染色體重構(gòu)等。在乳腺癌病人中，CUL4A過(guò)度表達(dá)常與較差的預(yù)后密切相關(guān)。最近的研究證明，在前列腺癌中CUL4A與MDR相關(guān)，但是乳腺癌中

3、CUL4A與MDR的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　ERK1/2細(xì)胞信號(hào)通路對(duì)癌細(xì)胞增殖、侵襲力和生存具有調(diào)節(jié)功能。最近有研究顯示在前列腺癌細(xì)胞系中，CUL4A通過(guò)促進(jìn)H3K4me3與ERK1/2基因啟動(dòng)子的結(jié)合而促進(jìn)ERK1/2的表達(dá)。
　　根據(jù)以上報(bào)道，我們推測(cè)在乳腺癌中，CUL4A可能通過(guò)對(duì)ERK1/2通路的調(diào)節(jié)作用來(lái)調(diào)節(jié)MDR。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶骄咳橄侔┲蠧UL4A與MDR之間可能的關(guān)系及相應(yīng)機(jī)制。
　　材料和方法本

4、實(shí)驗(yàn)中我們將逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pBabe-puro-CUL4A及其相應(yīng)的空白質(zhì)粒pBabe-puro分別在逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)下感染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468和MCF7，構(gòu)建CUL4A穩(wěn)定表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞系;同時(shí)將pSuperretro-CUL4A及相應(yīng)的空白質(zhì)粒感染阿霉素耐藥的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468/Adr及MCF7/Adr，建立CUL4A基因沉默的細(xì)胞系。利用質(zhì)粒中包含的嘌呤霉素抗性基因進(jìn)行篩選，最終獲得高純度的、CU

5、L4A穩(wěn)定高表達(dá)或沉默的細(xì)胞系。
　　隨后，利用建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定藥物半數(shù)致死量，用于證明CUL4A的表達(dá)與P-gp底物藥物多藥耐藥的相關(guān)性。然后通過(guò)RT-PCR以及Westernblot技術(shù)，從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上檢測(cè)CUL4A對(duì)MDR1/P-gp表達(dá)的影響。隨后應(yīng)用已建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系及ERK1/2通路特異性抑制劑PD98059，進(jìn)一步分析CUL4A對(duì)細(xì)胞多藥耐藥的影響是否與ERK1/2通路有關(guān)。最后，在乳

6、腺癌臨床標(biāo)本上，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)CUL4A與ERK1/2、P-gp的表達(dá)，分析其相關(guān)性。
　　結(jié)果1）建立了對(duì)阿霉素耐藥以及CUL4A穩(wěn)定上調(diào)/下調(diào)的乳腺癌細(xì)胞系;2)在乳腺癌細(xì)胞中，CUL4A對(duì)MDR1的表達(dá)起到正向調(diào)節(jié)作用;3）MCF7/Adr細(xì)胞中CUL4A基因沉默導(dǎo)致P-gp底物藥物抵抗性的下降。反之在MCF7細(xì)胞中調(diào)高CUL4A的表達(dá)水平會(huì)導(dǎo)致Pgp底物藥物抵抗性的提高;4）CUL4A通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)激活ERK1/