G蛋白偶聯(lián)受體倡導的蛻皮激素非基因組途徑和保幼激素抑制變態(tài)的分子機理.pdf

1、研究背景及存在的科學問題：
　　昆蟲的生長和變態(tài)主要由蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenilehormone，JH)調(diào)控。在幼蟲生長期高滴度JH存在的條件下，20E滴度增加調(diào)控幼蟲不同齡期間的蛻皮。在末齡幼蟲轉(zhuǎn)變?yōu)槌上x的變態(tài)期，JH滴度下降或消失，20E起始變態(tài)。20E的主要功能是促進蛻皮與變態(tài)，而JH主要維持幼蟲狀態(tài)。二者在體內(nèi)的滴度比例交互變化，功能既拮抗又統(tǒng)一，協(xié)同調(diào)控昆蟲發(fā)育。由

2、于20E是小分子脂溶性激素，早期研究認為20E通過滲透進入細胞膜，與胞內(nèi)受體ecdysonereceptor(EcR)結(jié)合，在熱休克蛋白幫助下與超氣門蛋白ultraspiracle(USP)形成EcR-USP轉(zhuǎn)錄復合體，結(jié)合在DNA啟動子上，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)蛻皮與變態(tài)，即20E基因組途徑。目前已有一些研究報道20E能夠通過細胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)引起Ca2+信號增強，蛋白快速移位和磷酸化，環(huán)腺苷酸水平升高等細胞快速應

3、答反應，這暗示20E存在非基因組途徑。JH也是小分子脂類激素，研究認為JH也是通過滲透進入細胞內(nèi)，結(jié)合胞內(nèi)受體methoprene-tolerant(Met)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。
　　20E和JH通過調(diào)控不同的基因轉(zhuǎn)錄控制昆蟲的生長和變態(tài)。研究報道絕緣小體蛋白modifierofmdg4[mod(mdg4)]通過與轉(zhuǎn)錄因子SuppressorofHairy-wing[Su(Hw)]形成絕緣小體來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及細胞凋亡。變態(tài)期昆蟲的中腸在

4、20E調(diào)控下發(fā)生程序性細胞死亡(PCD)，mod(mdg4)是否參與調(diào)控昆蟲變態(tài)期組織PCD相關基因表達還沒有報道。GPCRs是最大的膜蛋白家族，它們參與調(diào)控激素、神經(jīng)遞質(zhì)等激活的細胞生理反應。在果蠅中發(fā)現(xiàn)多巴胺GPCR受體可以結(jié)合蛻皮激素，家蠶絲腺中GPCR參與了蛻皮激素調(diào)控的程序性細胞死亡，但蛻皮激素的GPCR受體及介導的信號途徑少有報道。Broad(Br)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，20E調(diào)控Br高表達起始變態(tài)。在幼蟲生長期，JH通過抑

5、制Br表達來抑制20E途徑，但給幼蟲注射JH卻能夠上調(diào)Br表達并抑制變態(tài)過程，JH調(diào)控Br表達的分子機制尚未闡明。另外Br蛋白本身的穩(wěn)定性問題也研究甚少。本論文選擇mod(mdg4)、GPCRs和Br作為靶標基因，研究蛻皮激素的非基因組途徑及保幼激素抑制變態(tài)的分子機理，豐富激素調(diào)控昆蟲發(fā)育的理論知識，為害蟲控治提供靶標基因。
　　研究結(jié)果與結(jié)論：
　　1.mod(mdg4)1A蛋白參與激素調(diào)控的中腸程序性細胞死亡
　　

6、Mod(mdg4)1A在變態(tài)期的表皮、中腸和脂肪體中高表達，并定位于變態(tài)期幼蟲中腸。當mod(mdg4)1A被干擾后，幼蟲變態(tài)過程被延遲，中腸PCD被抑制，促進PCD和變態(tài)發(fā)生的相關基因的轉(zhuǎn)錄被顯著抑制。20E并不通過經(jīng)典的EcRB1-USP1基因組途徑上調(diào)mod(mdg4)1a表達，而Methoprene可以通過JH核受體Met1上調(diào)mod(mdg4)1a表達。20E和methoprene可以分別上調(diào)mod(mdg4)1a表達，但疊加

7、卻抑制mod(mdg4)1a表達。結(jié)論:mod(mdg4)1A在20E和JH調(diào)控下通過調(diào)控基因網(wǎng)絡的轉(zhuǎn)錄水平參與中腸PCD和變態(tài)。
　　2.G蛋白偶聯(lián)受體ErGPCR在細胞膜上參與蛻皮激素介導的信號途徑
　　ErGPCR在幼蟲的蛻皮期和變態(tài)期高表達。當蟲體注射dsErGPCR后，幼蟲-蛹的轉(zhuǎn)變和20E應答基因的轉(zhuǎn)錄均被抑制，而細胞系過表達ErGPCR增強20E應答基因表達。沉默ErGPCR能夠抑制胞內(nèi)Ca2+濃度增加并抑制2

8、0E誘導的Calponin快速入核和磷酸化。T型電壓門控鈣離子通道抑制劑和經(jīng)典瞬時受體電壓鈣離子通道抑制劑能夠抑制20E誘導的胞內(nèi)Ca2+濃度升高，并抑制基因表達和蛋白質(zhì)磷酸化。N末端缺失的ErGPCR突變體定位于細胞質(zhì)并不能增強20E相關基因轉(zhuǎn)錄。ErGPCR不能與20E類似物[3H]IPonA結(jié)合。20E可以通過ErGPCR調(diào)控EcRB1-USP1基因組途徑，也可以通過ErGPCR而不通過EcRB1-USP1調(diào)控mod(mdg4)1

9、A表達。結(jié)論:20E通過ErGPCR調(diào)控Calponin快速入核和磷酸化，誘導胞內(nèi)Ca2+濃度升高，調(diào)控20E應答基因表達并參與幼蟲-蛹的轉(zhuǎn)變過程。
　　3.JH通過調(diào)控新型BroadⅡ磷酸化抑制變態(tài)
　　本研究從棉鈴蟲中發(fā)現(xiàn)一種新型Br蛋白BroadⅡ(BrZ-Ⅱ)。蟲體干擾BrZ-Ⅱ后，幼蟲的變態(tài)過程和20E應答基因的轉(zhuǎn)錄均被顯著抑制。在幼蟲生長時期，BrZ-Ⅱ表達量比較低并處于磷酸化狀態(tài);而在變態(tài)時期，BrZ-Ⅱ保持高

10、表達的非磷酸化狀態(tài)。G蛋白偶聯(lián)受體，磷脂酶C，和蛋白激酶C抑制劑均能抑制JH誘導的BrZ-Ⅱ磷酸化。JH誘導的磷酸化的BrZ-Ⅱ能夠與Calponin非編碼區(qū)的Br結(jié)合元件結(jié)合。蟲體注射JHⅢ誘導BrZ-Ⅱ磷酸化，抑制20E相關基因表達并阻止變態(tài)。JH誘導非磷酸化的Calponin與超氣門蛋白USP1結(jié)合激活JH途徑并抑制20E途徑。結(jié)論:體內(nèi)JH調(diào)控BrZ-Ⅱ磷酸化來介導JH應答基因表達指導幼蟲生長;20E調(diào)控BrZ-Ⅱ高表達和非磷酸

11、狀態(tài)參與變態(tài)。外源JH誘導BrZ-Ⅱ高表達及磷酸化直接調(diào)控Calponin高表達，非磷酸化的Calponin與USP1結(jié)合激活JH途徑從而抑制20E信號途徑并抑制變態(tài)過程。
　　4.熱休克蛋白90結(jié)合BroadⅡ的BTB結(jié)構域保持其穩(wěn)定性和功能
　　在體內(nèi)和體外Hsp90均能結(jié)合BrZ-Ⅱ，Hsp90通過中間結(jié)構域與BrZ-Ⅱ的BTB結(jié)構域結(jié)合。Hsp90抑制劑17-allylamino-17-desmethoxygelda

12、namycin(17-AAG)能夠抑制Hsp90與BrZ-Ⅱ的結(jié)合，導致BrZ-Ⅱ蛋白水平降低但不影響B(tài)rZ-Ⅱ的mRNA水平。蛋白酶體抑制劑MG-132能夠抑制17-AAG誘導的BrZ-Ⅱ降解。BrZ-Ⅱ的BTB結(jié)構域缺失或17-AAG預處理能夠抑制Hsp90與BrZ-Ⅱ的結(jié)合，并抑制BrZ-Ⅱ在20E和JH信號途徑中的基因調(diào)控功能。結(jié)論:Hsp90通過中間結(jié)構域與BrZ-Ⅱ的BTB結(jié)構域結(jié)合。Hsp90與BrZ-Ⅱ的結(jié)合對于BrZ-

13、Ⅱ的穩(wěn)定性及其在20E和JH信號途徑中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能是必需的。
　　研究成果及科學意義：
　　mod(mdg4)1A的研究結(jié)果一方面深入闡明了20E和JH相互作用調(diào)控昆蟲中腸PCD的分子機制，另一方面揭示了20E存在除EcR/USP經(jīng)典基因組途徑之外的信號途徑。有關ErGPCR的研究結(jié)果為20E非基因組途徑提供了新的實驗依據(jù)，將非基因組途徑與基因組途徑聯(lián)系起來，并證明20E存在多種信號途徑。JH誘導一種新型Br蛋白BrZ-Ⅱ