G蛋白偶聯(lián)受體2在細胞膜上的控制蛻皮激素信號通路及調(diào)控下游效應(yīng)的研究.pdf

1、研究背景及國內(nèi)外研究進展
　　昆蟲是世界上種類最多的生物類群，其發(fā)育大多數(shù)經(jīng)歷蛻皮和變態(tài)兩種主要的生理過程。昆蟲的生長發(fā)育主要由蛻皮激素(20E)和保幼激素(JH)控制。在昆蟲幼蟲階段JH滴度較高，蟲體維持其幼蟲狀態(tài);在蛻皮變態(tài)期JH滴度逐漸降低，而此時20E滴度逐漸升高，最終起始昆蟲的蛻皮變態(tài)。這兩種激素協(xié)調(diào)控制昆蟲的蛻皮與變態(tài)過程。研究這一過程的分子調(diào)控機制不僅可以為害蟲防治提供科學(xué)依據(jù)，而且可以為研究人類疾病的分子機制提供參

2、考。
　　先前研究發(fā)現(xiàn)蛻皮激素主要是通過核受體ecdysone receptor(EcR)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號起始昆蟲的變態(tài)。近些年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)水平的日趨提高，研究人員發(fā)現(xiàn)了20E激素信號通路存在非基因組途徑。許多信號通路中的蛋白質(zhì)會發(fā)生快速的磷酸化修飾及移位現(xiàn)象。20E也可動員細胞內(nèi)鈣離子的釋放及內(nèi)流。與此同時，20E非基因組途徑的膜受體也成為研究的熱點。目前在許多物種中都發(fā)現(xiàn)了G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)參與動物類固醇激素的非基

3、因組信號通路，但是具體的機制尚不清楚。
　　鈣離子是細胞內(nèi)的第二信使，調(diào)控多種生理過程，包括基因轉(zhuǎn)錄、細胞增殖和細胞凋亡等。類固醇激素20E在昆蟲變態(tài)過程中促進程序性細胞死亡，而保幼激素JH拮抗20E的功能來阻止變態(tài)的發(fā)生。20E和JH都能誘導(dǎo)細胞內(nèi)鈣離子水平的增加。然而，這兩種功能相互拮抗的激素誘導(dǎo)鈣離子水平增加的分子機制及生理結(jié)果仍不明確。在這項研究中，我們篩選到在鱗翅目昆蟲棉鈴蟲中的ErGPCR-2作為靶標基因，研究GPCR

4、在20E非基因組途徑中的功能，以及鈣離子作為第二信使在20E調(diào)控的細胞凋亡中的分子機制。豐富和完善了20E信號途徑及昆蟲生長發(fā)育的理論知識。同時為害蟲防治及人類疾病治療提供靶標基因和科學(xué)依據(jù)。
　　研究結(jié)果
　　1.G蛋白偶聯(lián)受體2在細胞膜上控制蛻皮激素信號通路
　　在這項研究中，我們篩選到了鱗翅目昆蟲棉鈴蟲中的一個GPCR，命名為ErGPCR-2，在細胞膜上控制類固醇激素20-羥基蛻皮酮信號通路。ErGPCR-2在棉

5、鈴蟲的蛻皮和變態(tài)時期具有較高的表達。20E通過ErGPCR-2調(diào)控棉鈴蟲表皮細胞系中鈣離子水平快速變化、有關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化、相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以及蟲體的變態(tài)發(fā)育過程。ErGPCR-2定位于細胞膜上，在20E的誘導(dǎo)條件下，ErGPCR-2會被G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(GRK2)所磷酸化，磷酸化修飾后的ErGPCR-2被內(nèi)吞入細胞質(zhì)中。內(nèi)吞入細胞質(zhì)后的ErGPCR-2被蛋白酶所降解，最終脫敏20E信號通路。細胞系干擾ErGPCR-2減少了20E的類

6、似物[3H] ponasterone A([3H]Pon A)進入細胞的量。細胞系過表達ErGPCR-2和干擾GRK2阻止ErGPCR-2的內(nèi)吞，都會增加[3H]Pon A進入細胞的量。然而，我們沒有檢測到ErGPCR-2蛋白直接結(jié)合于[3H]Pon A。結(jié)果表明ErGPCR-2在細胞膜上傳導(dǎo)類固醇激素20E信號并且控制20E進入細胞。
　　2.蛻皮激素促進鈣離子動員并引起細胞凋亡
　　20E通過GPCR誘導(dǎo)細胞內(nèi)較強的鈣離

7、子水平升高，而JH通過受體酪氨酸激酶(RTKs)誘導(dǎo)較小的鈣離子水平增加。鈣釋放激活鈣通道1(Orai1)和瞬時受體電位通道(TRPs Channel)，對20E誘導(dǎo)快速鈣離子內(nèi)流是必需的。相對于JH，20E處理細胞會引起鈣離子維持在長時間的高水平狀態(tài)，并且提高了更多的鈣通道相關(guān)基因的表達，包括Orai1和TRP通道等。20E會激活Caspase3/7和促凋亡基因的表達，而JH不能。JH可以抑制20E誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流、Caspase3/7的

8、激活和凋亡相關(guān)基因的表達。高水平的鈣離子誘導(dǎo)細胞凋亡。這些結(jié)果表明，20E和JH通過不同的途徑調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣并且維持鈣離子在不同的穩(wěn)態(tài)水平，因此導(dǎo)致不同的基因表達和細胞生理反應(yīng)。
　　研究結(jié)論及科學(xué)意義
　　1.ErGPCR-2在細胞膜上控制20E進入細胞
　　ErGPCR-2定位于細胞膜上控制[3H]PonA進入細胞。ErGPCR-2在細胞膜上調(diào)控20E信號通路。這一研究完善了20E非基因組途徑的科學(xué)知識，建立了基因組

9、途徑與非基因組途徑的連接，為今后研究20E信號途徑提供了全新的理論依據(jù)。
　　2.蛻皮激素促進鈣離子動員引起細胞凋亡
　　20E通過GPCR動員細胞內(nèi)較強的鈣水平升高，而JH通過RTKs動員較弱的鈣水平增加。20E處理細胞會引起鈣離子在細胞質(zhì)中維持在長時間的高水平狀態(tài)，20E上調(diào)更多鈣通道相關(guān)基因的表達。20E誘導(dǎo)Caspase3/7活化水平、促進細胞細胞死亡和上調(diào)促凋亡基因的表達，高水平的鈣離子誘導(dǎo)細胞凋亡。鈣離子作為細胞