三疣梭子蟹蛻皮周期中蛻皮激素濃度的變化【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　三疣梭子蟹蛻皮周期中蛻皮激素濃度的變化 </p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄<

3、/b></p><p><b>　　1引言1</b></p><p><b>　　2材料和方法1</b></p><p><b>　　2.1 材料1</b></p><p>　　2.2 主要儀器設(shè)備與試劑1</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)

4、方法2</p><p>　　2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制2</p><p>　　2.3.2色譜和質(zhì)譜條件UPLC條件3</p><p>　　2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限3</p><p>　　2.3.4血淋巴蛻皮激素濃度的變化的測量3</p><p><b>　　3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3</b><

5、;/p><p>　　3.1 檢測獲得的蛻皮激素濃度3</p><p>　　3.2數(shù)據(jù)分析結(jié)果4</p><p><b>　　4結(jié)論5</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)5</b></p><p&g

6、t;　　附錄錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：甲殼動物Y器(Y-organ)分泌的蛻皮類固醇激素對其蛻皮過程起重要調(diào)控作用。利用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法完成三疣梭子蟹蛻皮過程中血淋巴蛻皮激素濃度變化的測定。隨著蛻皮周期的運(yùn)行基本處于逐漸升高的趨勢，蛻皮后期(A/B)蛻皮激素的濃度較低，低于儀器檢測限0.03ng/mL。進(jìn)入蛻皮間期后，蛻皮激素的濃度開始逐漸恢復(fù)正常1.393

7、±0.245ng/mL。進(jìn)入蛻皮前期蛻皮激素濃度逐漸上升，D0，D1，D2其濃度分別為4.547±0.372ng/mL，6.406±0.438ng/mL和8.135±0.423ng/mL；而在蛻皮前期D3期達(dá)到最高峰20.071±1.327ng/mL，D4有所回落變?yōu)?0.313±0.511ng/mL。該研究結(jié)果證實(shí)蛻皮類固醇激素對三疣梭子蟹蛻皮過程起重要調(diào)控作用。</p

8、><p>　　關(guān)鍵詞：三疣梭子蟹；蛻皮周期；蛻皮激素；LC-MS/MS</p><p>　　Abstract: Crustacean Y control (Y-organ) steroid hormone secreted by their molting molting process plays an important regulatory role.High performance l

9、iquid chromatography - tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method to complete the process of Portunus trituberculatus molting ecdysteroid hemolymph concentration determination. With the molt cycle, running basically at t

10、he increasing tendency, molt later (A/B) low concentrations of ecdysone, below the instrument detection limit of 0.03 ng/mL. Int</p><p>　　Key words: Portunus trituberculatus；moulting cycle；ecdysone；LC-MS/MS&

11、lt;/p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）屬節(jié)肢動物門（Arthropods）、甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、梭子蟹科（Portunidae），分布于我國遼東半島、山東半島到廣東、廣西的各海區(qū)以及日本、朝鮮、馬來西亞群島等海域，是一種大型海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類。作為重

12、要的大型經(jīng)濟(jì)蟹類，三疣梭子蟹肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，食用價(jià)值高，不僅是我國傳統(tǒng)的名貴海鮮，也是一種重要的出口海產(chǎn)品。20世紀(jì)90年代中期開始，三疣梭子蟹的大規(guī)模育苗和養(yǎng)殖在我國逐漸推廣，現(xiàn)今三疣梭子蟹已是世界上養(yǎng)殖規(guī)模最大的海洋經(jīng)濟(jì)蟹類之一。</p><p>　　蛻皮激素是一種類固醇激素，它既存在于無脊椎動物（主要是節(jié)肢動物）中，也存在于植物中。甲殼動物蛻皮激素由Y器（又稱為蛻皮腺，與昆蟲的前胸腺為同功器官）合成、分

13、泌[1,2]。目前國內(nèi)已有人對甲殼動物蛻皮腺及蛻皮激素做了一些研究，如葉海輝等[1]采用組織切片和電鏡技術(shù)，對鋸緣青蟹大顎器、Y器的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，以及陸劍峰、趙維信[3]對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）Y-器官在蛻皮周期中的超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)而指出其對蛻皮過程的影響。目前尚無人研究三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的蛻皮周期，作為中國沿海重要的經(jīng)濟(jì)蟹類，剛蛻完殼的軟殼蟹的體積比蛻殼前增加了

14、30%-40%,其殼通過環(huán)境中的鈣鹽等不斷硬化而恢復(fù)正常硬度，三疣梭子蟹的個(gè)體增長在外表上并不連續(xù)，而是呈階梯形，每蛻一次皮，上一個(gè)臺階。由此可見，三疣梭子蟹的生長發(fā)育與蛻皮息息相關(guān)，促進(jìn)蛻皮的發(fā)生，可促進(jìn)其發(fā)育成熟，提高產(chǎn)量。了解蛻皮發(fā)生的時(shí)間，周期的長短對促進(jìn)沿海三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展非常重要。</p><p>　　節(jié)肢動物的蛻皮激素主要是指20-羥基蛻皮酮（20E），有關(guān)研究多集中于它對人類和各種動物種類的

15、促進(jìn)生長作用方面。臨床研究表明，20E可以很好地促進(jìn)生物生理代謝,而且不產(chǎn)生副作用。但甲殼類蛻皮激素濃度達(dá)到200-400mg/L時(shí)，會出現(xiàn)外皮加厚等中毒現(xiàn)象。因此，應(yīng)關(guān)注蛻皮激素在甲殼動物中的含量變化，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中應(yīng)保證生物體內(nèi)蛻皮激素含量處于合適的范圍內(nèi)[4]。1953年Gabe首次描述了58種軟甲亞綱（Malacostraca）種類的Y器，而切甲亞綱（Entomostraca）種類沒有Y器[5]。Y器分泌的蛻皮類固醇不具生物活性

16、，只有進(jìn)入血淋巴，在外周組織20-羥化酶的催化作用下才轉(zhuǎn)化成具有生物活性的20-羥蛻皮酮[6]。即是說Y器官產(chǎn)生a-蛻皮酮，進(jìn)入血液后轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)、實(shí)際的蛻皮激素是20羥蛻皮酮（β-蛻皮酮）。Y器官能從血液中吸收由食物中獲得的膽固醇合成類固醇激素。脊椎動物類固醇激素在血液中通常是與攜帶蛋白結(jié)合在一起運(yùn)輸?shù)模诩讱游镅褐羞€未發(fā)現(xiàn)與類固醇激素結(jié)合的蛋白，至少95％的此類激素是自由運(yùn)行的。研究表明，20-羥蛻皮酮不僅參與甲殼動物的蛻皮

17、活動和胚胎發(fā)育，而且參與了</p><p>　　本文利用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法完成三疣梭子蟹蛻皮過程中血淋巴蛻皮激素濃度變化的測定，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為海洋甲殼動物蛻皮等生長發(fā)育過程的生理學(xué)研究提供參考。</p><p><b>　　2材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 材料<

18、;/b></p><p>　　三疣梭子蟹自海中捕撈后在寧波寧海長街得水育苗場養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)，雌雄各半。體寬在9-11cm之間，體重在45-65g之間，放養(yǎng)在相同條件的育苗池內(nèi)，海水鹽度、水溫以及水體溶解氧濃度、喂食量等相同，并且保證池內(nèi)的梭子蟹都能正常生長發(fā)育，從而減小因?yàn)椴煌h(huán)境條件而造成的誤差。本實(shí)驗(yàn)用水為寧海縣得水水產(chǎn)苗種場蟹苗池海水，該海水取自自然海區(qū)，經(jīng)過幾天的沉淀池暗沉淀和兩次砂濾池過濾。海水進(jìn)入

19、育苗池后用增氧泵進(jìn)行水體增氧，保證水體的溶解氧充足。實(shí)驗(yàn)樣本均為未經(jīng)過生殖蛻皮的三疣梭子蟹。</p><p>　　2.2 主要儀器設(shè)備與試劑</p><p>　　OLYMPUS CX21FS1顯微鏡；</p><p>　　ppendorf AG 22331 Hambury 24500離心機(jī)；</p><p>　　OPLENIC5818觀測目鏡

20、；</p><p>　　TSQ Quantum Access液相色譜一三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Finnigan公司），配有ESI源；</p><p>　　超純水系統(tǒng)（法國MILLIPORE公司）；</p><p>　　20-羥基蛻皮酮和高油菜素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%，美國SIGMA-ALDRICH公司）；</p><p>

21、　　乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；</p><p>　　純水由超純水系統(tǒng)制備；</p><p>　　其他試劑均為國產(chǎn)分析純，生物冰袋冰盒。</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　蛻皮的整個(gè)過程包括蛻去舊甲殼，個(gè)體由于吸水迅速增大，然后新甲殼形成并硬化。因此甲殼動物的個(gè)體增長在外形

22、上并不連續(xù)，呈階梯形，每蛻一次皮，上一個(gè)臺階。參照傳統(tǒng)甲殼動物蛻皮階段的劃分，結(jié)合三疣梭子蟹類本身所獨(dú)有的特點(diǎn)，以游泳足末節(jié)新舊表皮間距/舊表皮厚度的比值為主要依據(jù)，將三疣梭子蟹蛻皮周期劃分為蛻皮后期（A和B），蛻皮間期(C)，蛻皮前期（D0，D1，D2，D3和D4）以及蛻皮期（E）等四個(gè)階段[12]。</p><p>　　目前檢測生物體內(nèi)蛻皮激素的方法有薄層掃描法、放射免疫測定法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

23、法等[13,14]。液相色譜法和薄層掃描法靈敏度較低，而放射化學(xué)法無法進(jìn)行精確定性分析，并且三疣梭子蟹抗原抗體的的制備比較繁瑣。雖然國際上有更好的高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜分析方法等，但針對于三疣梭子蟹本方法液相色譜-質(zhì)譜分析方法操作簡便，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，已經(jīng)應(yīng)用于哺乳動物及昆蟲體內(nèi)蛻皮激素的痕量檢測[14]。</p><p>　　LC/MS 的聯(lián)用始于70年代，90年代以來，由于大氣壓電離的成功應(yīng)用以

24、及質(zhì)譜本身的發(fā)展，液相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用，特別是與串聯(lián)質(zhì)譜（MSPMS）的聯(lián)用得到了極大的重視和發(fā)展。LC–MS/MS 聯(lián)用的優(yōu)點(diǎn)非常顯著，因?yàn)闅庀嗌V只能分離易揮發(fā)且不分解的物質(zhì)，而液相色譜則把分離范圍大大拓寬了，生物大分子也能分離，LC與高選擇性、高靈敏度的MS/MS結(jié)合，可對復(fù)雜樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，即使在LC難分離的情況下，只要通過MS1及MS2對目標(biāo)化合物進(jìn)行中性碎片掃描，則可發(fā)現(xiàn)并突出混和物中的目標(biāo)化合物,顯著提高信噪比[15]。

25、</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用電噴霧電離(ESI)接口，圖1為ESI示意圖。溶液中樣品流出毛細(xì)管噴口后，在霧化氣(N2 )和強(qiáng)電場(3～6kV)作用下，溶液迅速霧化并產(chǎn)生高電荷液滴。隨著液滴的揮發(fā)，電場增強(qiáng),離子向液滴表面移動并從表面揮發(fā)，產(chǎn)生單電荷或多電荷離子。通常小分子得[M+H]+或[M-H]-單電荷離子，生物大分子產(chǎn)生多電荷離子，由于質(zhì)譜儀測量的是質(zhì)P荷比(m/z)，可測定的生物大分子的質(zhì)量數(shù)高達(dá)幾十萬

26、。ESI是很軟的電離，可直接測定熱不穩(wěn)定的極性化合物，多電荷形成可分析蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子，調(diào)節(jié)離子源(源內(nèi)ID)電壓可以控制離子的斷裂，給出結(jié)構(gòu)信息。</p><p>　　圖1電噴霧電離示意圖</p><p>　　Fig.1 Schematic diagram of electrospray ionization</p><p>　　2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配

27、制 </p><p>　　準(zhǔn)確稱取5.0mg20E標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇溶解并定容至1.0 mL，配制成5g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置4 ℃冰箱中保存。制作工作曲線時(shí)，用甲醇將此儲備液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每份標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入高油菜素內(nèi)酯，使其含量達(dá)到100 mg/L。</p><p>　　圖2 20-羥基蛻皮酮(a)和高油菜素內(nèi)酯(b)的結(jié)構(gòu)式</p><p>　　Fig.2

28、Structures of 20-hydroxyecdysone(a)and 22(S), 23(S)-homobrassinolide(b)</p><p>　　2.3.2色譜和質(zhì)譜條件UPLC條件</p><p>　　Hypersil Gold C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 mm，美國Thermo Fisher Scientific 公司)，進(jìn)

29、樣量10m，柱溫40℃，流動相為0.5%乙酸(A)和乙腈(B)，流速0.2 mL/min。梯度洗脫：0-8 min，10% -100% B；8-10 min，100% B；10-12 min，100% -10% B；12-16 min，10% B。</p><p>　　Q-TOF MS條件：采用電噴霧電離源負(fù)離子電離模式，毛細(xì)管電離電壓2.3 kV，取樣錐孔電壓25 V，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度250℃，脫

30、溶劑氮?dú)饬魉?00L/h，錐孔反吹氮?dú)?。四極桿掃描范圍m/z200-1000，碰撞室能量4V，TOF離子飛行方式采用V模式。分別提取m/z 407.2和437.2作為皮質(zhì)醇和地塞米松定量目標(biāo)離子，使用亮腦啡肽（m/z 554.2615）作為外標(biāo)物對目標(biāo)離子進(jìn)行精確質(zhì)量鎖定。</p><p>　　Q-Q-Q MS條件：采用電噴霧電離源負(fù)離子電離模式，離子化條件與Q-TOF MS條件同。采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測方式，皮質(zhì)

31、醇定量離子對m/z 407.2/331.4，碰撞能量l8 V，定性輔助離子對m/z 407.2/361.5，碰撞能量l2 V；地塞米松定量離子對m/z 437.2/361.5，碰撞能量l8 V。各離子對駐留時(shí)間均為200 ms[14]。</p><p>　　2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限</p><p>　　分別配制含1，5，10，20和50 mg/L 20E及100 mg/L高油菜素內(nèi)酯的混

32、合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用上述質(zhì)樸條件進(jìn)行LC-MS 分析。在0-50 mg/L 范圍內(nèi)線性方程式為Y =0.8013X-0.1768，相關(guān)系數(shù)R2 =0.9978。由于甲殼動物蛻皮激素含量通常很低,均在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，故采用此標(biāo)準(zhǔn)曲線對三疣梭子蟹血淋巴中的蛻皮激素進(jìn)行定量分析。對10 mL0.2 mg/L 20E標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分析，測得20E(m/z 481.2)定量特征碎片離子(m/z 445.2)的信噪比S/N=18。將對應(yīng)S/N=3的標(biāo)準(zhǔn)

33、樣品量作為檢出限,可算出本方法20E的檢出限為0.03 mg/L[3]。</p><p>　　2.3.4血淋巴蛻皮激素濃度的變化的測量</p><p>　　分別從蟹的游泳足基部抽取300μL血淋巴，加入含有1200μL乙腈和20μL 100ng/mL內(nèi)標(biāo)物高油菜素內(nèi)酯的1.5 mL離心管內(nèi)，輕微渦旋震蕩，8500r/min 高速離心15min。而后吸取上清液1mL（勿將底部蛋白吸入）于滅菌

34、1.5mL離心管中，做好標(biāo)記冰箱下層-20℃保存，在一個(gè)星期之內(nèi)送回寧波大學(xué)，而后將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用0.2mL純甲醇復(fù)溶，進(jìn)行液質(zhì)分析。根據(jù)樣品中20-羥基蛻皮酮（20E）特征離子響應(yīng)強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)物高油菜素內(nèi)酯的特征離子響應(yīng)強(qiáng)度比值，用加入內(nèi)標(biāo)的工作曲線法求得樣品中20-羥基蛻皮酮的含量。</p><p><b>　　3實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　3.1 檢

35、測獲得的蛻皮激素濃度</p><p>　　根據(jù)儀器測得的蛻皮激素峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，以及建立方法時(shí)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，計(jì)算獲得各個(gè)樣品中蛻皮激素的濃度（單位：ng/mL）結(jié)果見下表：</p><p>　　表1蛻皮各階段血淋巴中蛻皮激素濃度（單位：ng/mL）</p><p>　　Tab.1 Ecdysteroids in the hemolymph of i

36、ndividual crabs (unit: ng/mL)</p><p>　　整個(gè)蛻皮階段蛻皮激素的變化趨勢是比較明顯的，隨著蛻皮周期的運(yùn)行基本處于逐漸升高的趨勢，蛻皮后期(A/B)蛻皮激素的濃度較低，低于儀器檢測限0.33pg。進(jìn)入蛻皮間期后，蛻皮激素的濃度開始逐漸恢復(fù)正常1.393±0.245ng/mL。進(jìn)入蛻皮前期蛻皮激素濃度逐漸上升，D0，D1，D2其濃度分別為4.547±0.372

37、ng/mL，6.406±0.438ng/mL和8.135±0.423ng/mL；而在蛻皮前期D3期達(dá)到最高峰20.071±1.327ng/mL，D4有所回落變?yōu)?0.313±0.511ng/mL。</p><p><b>　　3.2數(shù)據(jù)分析結(jié)果</b></p><p>　　同一樣本三疣梭子蟹不同蛻皮周期蛻皮激素濃度進(jìn)行單因素方差

38、分析，認(rèn)為P<0.05時(shí)存在顯著性差異，P< 0.01時(shí)存在極顯著差異。</p><p>　　圖3 各樣本蛻皮周期濃度變化</p><p>　　Fig.3 Concentration of the molt cycle of the samples</p><p>　　如圖3所示，蟹血淋巴中20E在蛻皮前期D3呈現(xiàn)一個(gè)峰值，這與該時(shí)期水溫逐漸回升，促進(jìn)蛻

39、殼和加速生長有關(guān)，生長基本上呈直線上升，顯示了這階段的蟹快速生長無不與20E濃度水平升高有關(guān)。因此，為了提高蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量，在提供蟹的飼料中添加一定量的20E[2]，使蛻殼頻數(shù)增加，既能促進(jìn)蟹生長，加大個(gè)體重量，增大上市規(guī)格，又能達(dá)到同步蛻皮的目的，減少非同步蛻殼而造成的相互殘殺，減少死亡率，這為進(jìn)一步開發(fā)餐養(yǎng)殖業(yè)提供了理論依據(jù)和新的資料。</p><p><b>　　4結(jié)論</b></p

40、><p>　　三疣梭子蟹和其他甲殼動物一樣，其生長主要是通過蛻皮來實(shí)現(xiàn)的，且其大部分生理過程與蛻皮激素所控制的蛻皮周期有關(guān)。甲殼動物在一個(gè)蛻皮周期中，體內(nèi)蛻皮激素含量隨之發(fā)生周期性變化，這在許多甲殼動物中已得以證明[16-18]。蛻皮類固醇激素對三疣梭子蟹蛻皮過程起重要調(diào)控作用，分泌的蛻皮激素決定了蛻皮的程度。蛻皮激素在血液中的濃度變化有一個(gè)普遍規(guī)律，即在蛻皮前期，蛻皮激素在血液中的濃度逐漸升高，在臨近蛻皮時(shí)，形成一

41、個(gè)峰值，然后濃度迅速下降。在實(shí)際蛻皮時(shí)，處于低濃度狀態(tài)。至于蛻皮激素含量在整個(gè)生長發(fā)育階段是否存在周期性變化，尚缺乏研究[19,20]。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 葉海輝,李少菁,黃輝洋,等.鋸緣青蟹Ｙ器結(jié)構(gòu)與卵巢發(fā)育的研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 41(6):791-795.</p><p

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