三疣梭子蟹球狀病毒的人工感染與純化【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　三疣梭子蟹球狀病毒的人工感染與純化 </p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí)

2、生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b>

3、;</p><p><b>　　1引言2</b></p><p><b>　　2材料和方法2</b></p><p>　　2.1 材料、試劑、設(shè)備2</p><p>　　2.1.1 材料2</p><p>　　2.1.2 試劑2</p><p&g

4、t;　　2.1.3 儀器、耗材3</p><p><b>　　2.2 方法3</b></p><p>　　2.2.1蟹病毒人工感染3</p><p>　　2.2.2病蟹組織超薄切片制作與觀察3</p><p>　　2.2.3 由蟹病組織純化病毒3</p><p>　　2.2.4純化病毒的

5、負(fù)染、電鏡觀察4</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析4</b></p><p>　　3.1人工感染后三疣梭子蟹病癥4</p><p>　　3.2 病蟹組織超薄切片的電鏡觀察4</p><p>　　3.3由病蟹組織純化病毒4</p><p>　　3.4病毒致病性（致死性）驗(yàn)證6&

6、lt;/p><p><b>　　4 討論6</b></p><p>　　4.1病毒純化方法6</p><p>　　4.2病毒的致病性7</p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)8</b></p><p>　

7、　摘要：由寧波沿海采集患病三疣梭子蟹，勻漿后過濾，制備病毒勻漿液注射到健康梭子蟹中，同時(shí)設(shè)置PBS注射對(duì)照組。結(jié)果為實(shí)驗(yàn)組全部死亡，對(duì)照組無死亡情況。證實(shí)此前在自然感染組織中觀察到的球狀病毒對(duì)三疣梭子蟹具有強(qiáng)感染力，并且致死性較強(qiáng)。采用差速離心法，由患病三疣梭子蟹組織純化病毒，對(duì)純化的病毒進(jìn)行負(fù)染、電鏡下觀察，結(jié)果表明獲得了較純凈的病毒粒子，根據(jù)該病毒的形態(tài)、大小，此病毒疑似呼腸孤病毒。純化的病毒感染健康梭子蟹，實(shí)驗(yàn)組全部死亡，證實(shí)純化

8、后病毒完整并且有活力，純化方法有效。</p><p>　　關(guān)鍵詞：三疣梭子蟹；人工感染；純化</p><p>　　Abstract: 窗體頂端</p><p>　　請(qǐng)鍵入文字或網(wǎng)站地址，或者上傳文檔。</p><p>　　Abtracts: Sick Portunus trituberculatus specimens were colle

9、cted from coastal of Ningbo. Infected tissues were homogenated. After filteration, the virus homogenate was injected into healthy crab. Control crab group was injected with PBS. As a result, the experimental group were a

10、ll died while no death appeared in the control group. It confirmed that the spherical virus has strong infectious and lethal effect to P. trituberculatus. The virus were purified from infected crab tissues by multi-step

11、</p><p>　　顯示對(duì)應(yīng)的拉丁字符的拼音</p><p>　　Keywords: Portunus trituberculatus; Artificial infection; Purification </p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　三疣梭子蟹(Portunus trituber

12、culatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，廣泛分布于我國沿海，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的大型海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類[1]。三疣梭子蟹味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值極為豐富，是人們非常喜愛的水產(chǎn)品之一，同時(shí)也是很重要的出口品種，已逐漸成為我國海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種之一。浙江省沿海地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，寧波市一帶短短幾年內(nèi)就發(fā)展成了全國聞名的梭子蟹養(yǎng)殖基地。隨著三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷增

13、加，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，又因?yàn)樗艿胶Ｑ蟓h(huán)境的污染、養(yǎng)殖生產(chǎn)自身所帶來的污染、養(yǎng)殖技術(shù)水平等多方面的原因制約，三疣梭子蟹在養(yǎng)殖的過程中病害問題日趨突出[2]。各類疾病的發(fā)病率和危害程度有逐年上升的趨勢，并呈現(xiàn)出大規(guī)模發(fā)生和暴發(fā)性流行的趨勢。由于對(duì)病原不了解而盲目用藥，導(dǎo)致藥物濫用，不但提高了水產(chǎn)養(yǎng)殖的投入產(chǎn)出比，危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者的經(jīng)濟(jì)利益，而且打擊了消費(fèi)信心，影響到出口內(nèi)銷，嚴(yán)重困擾著梭子蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［3］。另外由于一些蝦蟹綜合

14、養(yǎng)殖的推廣，一些廣宿主病毒如白斑綜合癥桿狀病毒等也成為侵害三疣梭子蟹的病原</p><p>　　國內(nèi)外已報(bào)道的蟹類病毒有：水生呼腸孤病毒[5]、微核糖核酸病毒、藍(lán)蟹皰疹病毒、藍(lán)蟹螺旋病毒、河蟹顫抖病毒［6］，鋸緣青蟹桿狀病毒［7］，黃頭病毒等。對(duì)蟹類病毒的研究多集中在形態(tài)觀察水平上，尚未進(jìn)行分子鑒定及靈敏檢測方法構(gòu)建[8]。研究發(fā)現(xiàn)蟹類對(duì)黃頭病毒YHV具有較高的抵抗力，并不容易感染［9］。</p>

15、<p>　　國內(nèi)外有關(guān)三疣梭子蟹病毒研究的文獻(xiàn)極少，對(duì)三疣梭子蟹病毒的病原和病理研究也尚不深入。其中以對(duì)蝦白斑癥病毒（WSSV）[10]研究相對(duì)透徹：國內(nèi)一些研究所通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定試驗(yàn)蟹體內(nèi)各器官中WSSV含量,病理切片觀察瀕死蟹各器官組織病理改變的方法，對(duì)WSSV進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。</p><p>　　近年來，梭子蟹養(yǎng)殖中大規(guī)模爆發(fā)性死亡現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，至今還未得到微生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)

16、的明確鑒定。此類不明病害嚴(yán)重威脅著我國梭子蟹蟹類養(yǎng)殖業(yè)。通過對(duì)奉化三疣梭子蟹發(fā)生秋季大規(guī)模死亡樣品的病理觀察，發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞中存在大量球狀病毒。我們對(duì)人工養(yǎng)殖過程中的三疣梭子蟹秋季大量死亡的病樣進(jìn)行病毒純化，對(duì)純化的病毒進(jìn)行形態(tài)觀察，并用病毒對(duì)健康蟹進(jìn)行人工感染研究，以期為三疣梭子蟹病毒病害快速診斷、防治提供理論與技術(shù)支撐。</p><p><b>　　2材料和方法</b></p>

17、<p>　　2.1 材料、試劑、設(shè)備</p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　患病三疣梭子蟹由奉化市池養(yǎng)和灘涂梭子蟹養(yǎng)殖場采集。</p><p>　　梭子蟹及喂養(yǎng)梭子蟹的縊蟶購自寧波水產(chǎn)批發(fā)、零售市場。</p><p><b>　　2.1.2 試劑</b&g

18、t;</p><p>　　TNE緩沖液：50 mM Tris-HCl，400 mM NaCl，5 mM EDTA，pH＝7.6;</p><p>　　TM緩沖液：50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH 7.6，Tris 6.0578g，MgCl2.6H2O 2.0338g，H2O 1000ml;</p><p>　　0.1mol/lPBS緩沖液：

19、NaCl 8g，KCl0.2 g，Na2HPO4 1.44g，Na2HPO4?12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，H2O 400ml，調(diào)節(jié)pH＝7.6，補(bǔ)水至500ml;</p><p>　　混合蛋白酶抑制劑（PMSF）：用異丙醇配成100mg/ml;</p><p>　　Trizol試劑購自invitrogen，EDTA購置上海生工，青霉素，鏈霉素，Tris-HCl，NaC

20、l，EDTA，MgCl2，25%戊二醛，1%鋨酸，酒精，苯甲酸二丙烯醋，醋酸雙氧鈾一檸檬酸鉛，3%磷鎢酸鉀（PTA）。</p><p>　　2.1.3 儀器、耗材</p><p>　　高速離心機(jī)（beckman Avanti J-E由美國貝克曼庫爾特公司制造），低速離心機(jī)（D-37520 Dsterode 德國Thermo），超低溫冰箱（Thermo 991），勻漿機(jī)（PT 1600E P

21、OLYTRON Made in Switzerland by KENEMATICA/G），過濾器（AP-01P VACUUM PUMP 天津奧特賽思斯儀器有限公司），精密電子天平（JA12002 上海恒平科學(xué)儀器有限公司），超薄切片機(jī)(RMC POWER TOME XL)、透射電子顯微鏡（日立H－7650），0.45um、0.22um濾膜，濾紙，冰箱，針式濾頭，冰盒，注射針，剪刀，移液槍，覆有Formvar膜的銅網(wǎng)。</p>

22、<p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1蟹病毒人工感染</p><p>　　取病蟹組織進(jìn)行勻漿；勻漿液在4℃下，6000g離心10min；沉淀用少量PBS重新懸浮后再次離心；合并上清，經(jīng)0.45um、0.22um濾膜先后抽濾除雜；用0.22um針式濾器濾頭過濾除菌后按1000IU/ml加入青霉素和鏈霉素；插入冰盒，放4℃病

23、箱過夜，即為攻毒用病毒懸液。</p><p>　　將梭子蟹隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組四只蟹，對(duì)照組注射生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組每只由第四步足基部注射0.2ml病毒液并且每日投喂縊蟶，換水，觀察死亡情況。</p><p>　　2.2.2病蟹組織超薄切片制作與觀察</p><p>　　取人工感染發(fā)病的病蟹的鰓、胃和腸組織，切成１mm3的小塊, 按常規(guī)方法經(jīng)2.5%戊二醛和1%

24、鋨酸雙固定, 濃度梯度酒精脫水，苯甲酸二丙烯醋包埋，聚合。于切片機(jī)上制備超薄切片。經(jīng)醋酸雙氧鈾一檸檬酸鉛雙染色，在日立S-3400N電鏡下觀察、拍照并分析。</p><p>　　2.2.3 由蟹病組織純化病毒</p><p>　　取病蟹腮和肌肉，快速剪成碎塊，加200ml預(yù)先冰浴過的TNE緩沖液（50 mM Tris-HCl，400 mMNaCl，5 mM EDTA，pH 7.6）；0℃充

25、分勻漿；緩沖液中添加了1x的混合蛋白酶抑制劑（1mM PMSF）[6]。4℃下6000g離心10min，收集上清，沉淀用TNE重懸，勻漿1min, 6000 g離心10min合并上清。8000g，4℃離心20min,取上清。4℃下35000g離心1.5h，棄部分上清液，將沉淀的上層疏松部分用上清洗掉。下層結(jié)實(shí)的略帶白色的部分重懸于1ml的TM緩沖液（50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH 7.5）中。TM緩沖液中添加

26、了1mM PMSF。冰浴過夜。4℃下3500g離心5min，去除沉淀。上清在4℃下38000g離心1.5h。將沉淀的上層疏松部分用TM緩沖液沖洗掉。下層結(jié)實(shí)的白色的部分即純化的病毒粒子。取少量病毒固定于100ul25%的戊二醛中。</p><p>　　2.2.4病毒純化后的負(fù)染以及電鏡觀察</p><p>　　取蟹病組織純化后的病毒懸液，滴一滴此病毒懸液在載玻片上，把覆有Formvar膜的

27、銅網(wǎng)反扣在病毒懸液上，20min后，取下銅網(wǎng)，然后晾干。在病毒懸液中滴加的3%磷鎢酸鉀（PTA）負(fù)染5min，用濾紙吸去多余的染液，室溫下風(fēng)干，在日立H－7650透射電子顯微鏡下觀察。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1人工感染后三疣梭子蟹病癥</p><p>　　實(shí)驗(yàn)組梭子蟹攻毒后全部發(fā)病，病蟹臨死

28、前呈現(xiàn)活力差、四肢無力、肌肉顫抖、食欲差、行動(dòng)遲緩。腮絲呈黑化趨勢，肝臟部位稍呈紅色，部分步足變紅，個(gè)別可見肌肉渾濁，其他臟器肉眼觀察無明顯異常。上述癥狀出現(xiàn)后很快死亡，死亡率100%。對(duì)照組梭子蟹沒有出現(xiàn)死亡情況。</p><p>　　3.2 病蟹組織超薄切片的電鏡觀察</p><p>　　將三疣梭子蟹的組織進(jìn)行超薄切片，在電鏡下可以觀察到在切片中有明顯的病毒粒子的存在。各組織、器官包括

29、腮、腸、肌肉、心臟、肝胰腺、性腺均有感染，其中腸、肌肉、心臟感染嚴(yán)重，存在大量病毒，病毒核心直徑約20nm。感染情況及病毒粒子形態(tài)與自然感染一致。</p><p>　　圖1. 人工感染健康三疣梭子蟹超薄組織切片的電鏡觀察圖片</p><p>　　Fig1. Electron micrograph picture of viral particles from various tissue

30、of infected health crabs顯示對(duì)應(yīng)的拉丁字符的拼音</p><p>　　3.3由病蟹組織純化病毒</p><p>　　將患病三疣梭子蟹組織勻漿后經(jīng)過兩次差速離心，從患病三疣梭子蟹的組織，主要是內(nèi)臟中提取純化得到了大量病毒，經(jīng)過電鏡負(fù)染后可以觀察到大量的病毒粒子，且純度較高。成熟病毒粒子直徑約為60-120 nm，病毒呈球形。</p><p>　

31、　圖2-a　 圖2-b　 </p><p>　　圖2-c 圖2-d</p><p>　　圖2-e 圖2-f </p><

32、p>　　圖2：純化的病毒粒子的負(fù)染電鏡照片</p><p>　　Fig2: Purified viral particles (negative stain)</p><p>　　3.4病毒致病性（致死性）驗(yàn)證</p><p>　　在人工感染實(shí)驗(yàn)中，我們用純化的病毒對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行注射感染，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，每組四只蟹，在感染發(fā)病的周期內(nèi)，三疣梭子蟹全部死亡，且

33、死亡率高達(dá)100%，對(duì)照組沒有出現(xiàn)死亡情況。與養(yǎng)殖業(yè)中該病爆發(fā)時(shí)蟹群大量快速死亡現(xiàn)象相符，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該病毒對(duì)三疣梭子蟹具有致病性，且致死率極高。應(yīng)該引起水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重視。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p><b>　　4.1病毒純化方法</b></p><p>　　為了研究病毒的本質(zhì)并對(duì)病毒

34、性疾病進(jìn)行診斷，必須對(duì)病毒顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)和病毒遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，需要高度純凈的病毒制品并且獲得一定量純病毒顆粒[11]。因而當(dāng)前迫切任務(wù)之一仍是進(jìn)一步改進(jìn)病毒提純技術(shù)。目前，從感染動(dòng)物組織內(nèi)純化病毒的方法，主要有離心法、沉淀法和透析法等，其中超速離心法是應(yīng)用最為廣泛的一種純化病毒的方法［12］。超速離心法可分為平衡密度梯度離心法和等密度梯度離心法，較常使用的梯度材料有甘油、氯化銫、蔗糖和重水等。氯化銫［13］主要用于平衡密度梯

35、度離心法，其成本很高、價(jià)格較貴；蔗糖用于等密度梯度離心法，因?yàn)樗苡谒?，?duì)蛋白質(zhì)和核酸無不良影響，應(yīng)用相對(duì)來說更為普遍。密度梯度離心法［14］雖然是一種常用的病毒純化方法，但是它的缺點(diǎn)是操作復(fù)雜并且成本較高。差速離心是利用了不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。病毒純化時(shí)離心力的選擇通常是根據(jù)病毒大小、密度來確定的，對(duì)于中、大型病毒，

36、在8O000g離心60min，即能沉淀[15]。利用差速離心法提純各種大小的顆粒和病毒是一種有</p><p>　　在純化病毒的工作中，我們必須根據(jù)需要分離的病毒的特點(diǎn)，選擇適宜的純化方法。我們從對(duì)三疣梭子蟹分離純化的這種球狀病毒的研究結(jié)果表明，該病毒個(gè)體較小，一般的高速離心較難獲得純凈病毒。通過參考文獻(xiàn)[16][17]，我們?cè)O(shè)計(jì)了純化流程。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過多次低速離心時(shí)去除大部分的組織碎片后，通過調(diào)整病毒純化

37、緩沖液中鹽離子濃度，可以促進(jìn)病毒的沉降。同時(shí)在第一次高速離心后及時(shí)更換較低鹽離子濃度的緩沖液，可以更好的保護(hù)裸露的病毒粒子，盡量保持病毒粒子的完整性。通過上述方法獲得了較好的病毒純化效果：電鏡下觀察病毒較純凈、結(jié)構(gòu)完整；用純化的病毒對(duì)健康蟹進(jìn)行人工感染，致死率高。用純化的病毒進(jìn)行核酸分析發(fā)現(xiàn)其為RNA病毒，基因組分節(jié)，為呼腸孤病毒，這進(jìn)一步表明純化獲得成功，這也是在國內(nèi)外首次在三疣梭子蟹中發(fā)現(xiàn)呼腸孤病毒（另文發(fā)表）。雖然從核酸分析其為呼

38、腸孤病毒，但形態(tài)上該病毒與以往報(bào)導(dǎo)的呼腸孤科病毒有較大差異，可能是新病毒。</p><p><b>　　4.2病毒的致病性</b></p><p>　　在人工感染試驗(yàn)中，對(duì)照組未出現(xiàn)死亡。病毒注射感染組，所有個(gè)體均成功感染，出現(xiàn)食欲減退甚至停食、反應(yīng)遲緩等癥狀，且在感染后全部死亡，這與自然狀況下發(fā)病死亡的三疣梭子蟹的情況一致。通過對(duì)人工感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，此球狀病

39、毒為三疣梭子蟹發(fā)病死亡的病原，而且這種病毒對(duì)三疣梭子蟹有很強(qiáng)的致死性，三疣梭子蟹一旦感染這種病毒，經(jīng)過短暫的潛伏期后，快速死亡。由于這種疾病具有潛伏期短，發(fā)病快等特點(diǎn)，使得在該病的防治過程中存在一定的難度。</p><p>　　對(duì)感染瀕死個(gè)體三疣梭子蟹的組織病理觀察可見，病蟹肝胰腺、肌肉、鰓組織的靶細(xì)胞核腫大、變形，并出現(xiàn)以壞死為主的病變，電鏡下可在瀕死蟹的肝胰腺、肌肉等組織細(xì)胞中觀察到大量病毒粒子。成熟病毒粒子

40、直徑約為60-120 nm，病毒呈球形。</p><p>　　呼腸孤病毒是蟹類病毒中常見的一種病毒。呼腸孤病毒在鋸緣青蟹、中華絨螯蟹以及河蟹中曾被報(bào)道[18－20]。WENG 等[18]報(bào)道了一種新的鋸緣青蟹病毒性疾病“睡眠病(sleeping disease)”，病蟹的典型特征是肝胰腺萎縮。2004年5-11月該病在東南沿海福建省和廣東省廣泛流行，致螃蟹的死亡率非常高(在養(yǎng)殖塘中青蟹死亡率接近70%)。WEN

41、G 等通過一系列的實(shí)驗(yàn)證實(shí)青蟹類呼腸孤病毒是“睡眠病”發(fā)生的主要病原。該病毒在病蟹的心臟、鰓、肝胰腺和腸細(xì)胞等組織中廣泛分布，且在細(xì)胞漿中分散分布或呈晶格狀排列。貢成良[19]等在對(duì)江蘇等地的患顫抖病的中華絨螯蟹進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，該病的病原為一種球狀病毒，大小約為55nm。經(jīng)核酸電泳后證實(shí)該病毒為呼腸孤病毒。陳吉?jiǎng)俒20]等在對(duì)浙江省三門縣等地區(qū)患病鋸緣青蟹的組織電鏡切片觀察中發(fā)現(xiàn)大量的呼腸孤病毒，該病毒粒子的大小為60 nm 左右，二十

42、面體對(duì)稱，無囊膜。我們的研究發(fā)現(xiàn)，此次三疣梭子蟹中所純化得到的病毒在大小和形態(tài)等方面與已報(bào)道的蟹中感染的呼腸孤病毒均類似。在其后對(duì)該病毒進(jìn)行的進(jìn)一步研究結(jié)果證實(shí)了該病毒確實(shí)為呼腸孤病毒（另文闡述）。</p><p>　　此次對(duì)三疣梭子蟹病害的研究結(jié)果表明，呼腸孤病毒正是浙江地區(qū)三疣梭子蟹爆發(fā)性死亡的致病原，這在國內(nèi)外的三疣梭子蟹病害研究報(bào)道中尚屬首次。</p><p><b>　

43、　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 丁朋曉, 張連英. 養(yǎng)殖蟹類病害的研究進(jìn)展[M]. 畜牧與飼料科學(xué), 2010(31): 33－35.</p><p>　　[2] Momoyama K，Hiraoka M，Venegas, et al. Pathogenicity of penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV)to juveni

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