三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘弧菌群落結(jié)構(gòu)研究【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘弧菌群落結(jié)構(gòu)研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 海洋生物資源與

2、環(huán)境 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></p

3、><p><b>　　前言1</b></p><p><b>　　1材料與方法1</b></p><p>　　1.1 樣品采集1</p><p>　　1.2培養(yǎng)基錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　1.3儀器設(shè)備錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p&

4、gt;　　1.4 弧菌的分離、純化錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　1.5 弧菌基因組DNA的提取及16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　1.6 弧菌16S rDNA序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2 結(jié)果錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.1弧菌數(shù)量

5、比較錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2 弧菌群落結(jié)構(gòu)多樣性3</p><p>　　2.2.1 弧菌菌落類(lèi)型多樣性比較3</p><p>　　2.2.2 弧菌種屬分布多樣性比較4</p><p><b>　　3 討論6</b></p><p>　　3.1 養(yǎng)殖水體弧菌群落結(jié)構(gòu)與

6、病害的關(guān)系6</p><p>　　3.2 菌落類(lèi)型與種屬分布的聯(lián)系7</p><p>　　3.3 弧菌的培養(yǎng)特性及其對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響8</p><p><b>　　4 展望8</b></p><p><b>　　致謝8</b></p><p><b>　　參考

7、文獻(xiàn)9</b></p><p>　　摘要：采用平板計(jì)數(shù)、菌落形態(tài)觀察和16S rDNA序列比對(duì)的方法，對(duì)健康和發(fā)病的三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）養(yǎng)殖水體的弧菌(Vibrio)數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較研究。共分離得到42株弧菌，可分為5個(gè)菌落類(lèi)型（C1-C5），6個(gè)種。健康塘養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量為1.85-2.35×102 cfu/ mL，菌落主要分布在C1、

8、C2和C4這3個(gè)類(lèi)型，分布比較均勻，</p><p>　　V. alginolyticus有6株，為第一優(yōu)勢(shì)種，種屬分布也比較均勻；病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量為0.65-1.9×102 cfu/ml，菌落類(lèi)型主要集中在C1類(lèi)型，優(yōu)勢(shì)種為V. alginolyticus，與健康塘相比，病害塘養(yǎng)殖水體中的弧菌菌落類(lèi)型和種屬分布均比較集中。這些結(jié)果似乎表明三疣梭子蟹發(fā)病與群落結(jié)構(gòu)（比如弧菌的多樣性、致病性弧菌的

9、絕度優(yōu)勢(shì)地位）有直接關(guān)系，但與弧菌數(shù)量的關(guān)系無(wú)法從該實(shí)驗(yàn)得到。</p><p>　　關(guān)鍵詞：三疣梭子蟹； 養(yǎng)殖水體； 弧菌； 群落結(jié)構(gòu)； 16S rDNA</p><p>　　Abstract: We compare the number and the community structure of the vibrio in the healthy and diseased rearin

10、g water by plate count, colony category and 16S rDNA sequence alignment methods. There are 42 vibrio strains isolated from the rearing water. They can be divided into five groups (C1-C5) by colony category, and 6 species

11、 by sequencing. In the heathy pond, the number of the isolated vibrio is 1.85-2.35 × 102 cfu / mL, mainly contributed in the C1, C2 and C4 groups, V.alginolyticus is the fi</p><p>　　Keywords: Portunus

12、trituberculatus; rearing water; vibrio; community structure; 16S rDNA sequence </p><p><b>　　前言</b></p><p>　　三疣梭子蟹是我國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的不斷提高、養(yǎng)殖環(huán)境的污染，導(dǎo)致三疣梭子

13、蟹的抗病力下降，容易感染病原體，使得疾病頻繁發(fā)生，例如近幾年由弧菌引起的“乳化病”給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。國(guó)外早在20世紀(jì)初就有學(xué)者[2]對(duì)海水魚(yú)類(lèi)弧菌病進(jìn)行研究，自20世紀(jì)60年代后相繼對(duì)多種弧菌屬的致病菌有較豐富的研究和報(bào)道[3-6]。在三疣梭子蟹大規(guī)模養(yǎng)殖的過(guò)程中，由弧菌引起的死亡時(shí)有報(bào)道[7-8],是該行業(yè)發(fā)展的重要限制性因素。因此研究環(huán)境中弧菌群落結(jié)構(gòu)及數(shù)目規(guī)律，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品生產(chǎn)等與人類(lèi)生活及健康密切相

14、關(guān)的領(lǐng)域具有重要指導(dǎo)意義。</p><p>　　弧菌屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬，是一類(lèi)革蘭氏陰性、具極生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽胞的短桿狀細(xì)菌,其中有的弧菌有一定的彎曲,欠柔軟,有的彎曲不明顯。根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第9版) 收錄的弧菌屬的細(xì)菌有37種以上。弧菌科細(xì)菌廣泛分布于半咸水、河口、海洋的水體、沉積物中以及海洋生物的體表和腸道中。</p><p>　　目前，有關(guān)弧菌相

15、關(guān)疾病的病原鑒定、病理和組織生理變化的研究國(guó)內(nèi)已有不少報(bào)道如劉淇[9]，王國(guó)良[10]，施慧[11]，許文軍[12]，Jang-Seu Ki[13]等分別對(duì)上述弧菌相關(guān)方面進(jìn)行了研究，但是目前由弧菌引發(fā)的疾病與水體中弧菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系研究較少，有報(bào)道（倪純治等[14] ）過(guò)弧菌數(shù)量與蝦體弧菌相關(guān)疾病的關(guān)系，養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量常常被看做疾病爆發(fā)的重要征兆之一。沿海浮游細(xì)菌的基因型容易變異，因此基因類(lèi)型比較豐富[15]，弧菌主要分布在沿海水

16、域中，也有這個(gè)特點(diǎn)?；【N類(lèi)繁多，致病性菌株只占一小部分（據(jù)相關(guān)報(bào)道，溶藻弧菌(V. alginolyticus)、哈維氏弧菌（V.harveyi）等10多種弧菌可以引起海水養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病[16-17]，特別是夏季，一些弧菌暴發(fā)性增長(zhǎng)，使養(yǎng)殖對(duì)象出現(xiàn)皮膚潰爛，爛尾，出血等癥狀），大部分是非致病菌，這些非致病菌在水體凈化中還起著非常重要的作用，因此，相較于弧菌數(shù)量，弧菌群落的結(jié)構(gòu)組成可能與疾病爆發(fā)更為相關(guān)。</p><p

17、>　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是PCR和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使人們能夠利用16S rDNA序列來(lái)鑒定環(huán)境中弧菌菌種，來(lái)研究環(huán)境中的弧菌群落結(jié)構(gòu)。從環(huán)境中分離純化弧菌，提取各弧菌菌株的DNA，對(duì)細(xì)菌的16s rDNA區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，最后通過(guò)一些生物信息學(xué)的方法鑒定該弧菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。</p><p>　　我們選取兩個(gè)代表性的三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘，其中一個(gè)塘中梭子蟹發(fā)生類(lèi)似“牛奶病”的疾病，梭子蟹連續(xù)不斷死亡，

18、稱(chēng)為病害塘；另一個(gè)塘，沒(méi)有明顯的梭子蟹死亡跡象，稱(chēng)為健康塘。我們基于細(xì)菌計(jì)數(shù)、菌落特征和16S rDNA基因序列比對(duì)對(duì)這兩個(gè)三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘的養(yǎng)殖水體中的弧菌群落組成進(jìn)行了比較研究，以期進(jìn)一步揭示弧菌群落結(jié)構(gòu)變化與三疣梭子蟹疾病發(fā)生的關(guān)系。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 樣品采集</b>&l

19、t;/p><p>　　2010年7月24日9：30～12：00，寧波鄞州區(qū)瞻岐鎮(zhèn)三疣梭子蟹養(yǎng)殖場(chǎng)，陰雨，氣溫25-31℃，水溫28℃，我們按照《海洋調(diào)查規(guī)范》第6部分海洋生物調(diào)查（GB/T12763.6-2007）[18] 的要求選取健康不發(fā)病的養(yǎng)殖塘和發(fā)病嚴(yán)重的養(yǎng)殖塘各兩個(gè)，養(yǎng)殖塘面積為5-6畝，養(yǎng)殖密度為2000只/畝，于水深80cm左右處采取水樣。采樣前，開(kāi)動(dòng)水車(chē)30 min，以使水體充分混勻。樣品采集后均放在

20、裝有冰袋的密封泡沫箱中，并于6 h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。</p><p><b>　　1.2培養(yǎng)基</b></p><p>　　TCBS瓊脂的成分（g/L）[19]：酵母浸出粉5.0 g，蔗糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，枸櫞酸鐵1.0 g，枸櫞酸鈉10.0 g，BTB 0.04 g，硫代硫酸鈉10.0 g，瓊脂粉13.0 g，牛膽粉8.0 g。pH 8.6±0.

21、4</p><p><b>　　1.3儀器設(shè)備</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用到的實(shí)驗(yàn)儀器有：Eppendorf 離心機(jī)，BIO-RAD PCR儀，變性凝膠電泳儀，瓊脂糖凝膠電泳，RXZ智能型人工氣候箱，SP-DJ系列水平凈化工作臺(tái)，-20℃保存的冰箱，水浴鍋，搖床。</p><p>　　1.4 弧菌的分離、純化</p>

22、<p>　　三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘水體的弧菌計(jì)數(shù)、分離和純化均采用TCBS培養(yǎng)基。采集的水樣用無(wú)菌生理鹽水稀釋成3個(gè)梯度（10-1、10-2、10-3 ），每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行,取100 μL稀釋液涂布TCBS培養(yǎng)基平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)2～4 d，記錄各平板菌落數(shù)，并推算出原樣品的弧菌濃度，隨機(jī)挑取部分單菌落劃線分離純化3次，得到純化菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，記錄其形態(tài)特征，如顏色、質(zhì)地、表面形態(tài)等。</p>&

23、lt;p>　　1.5 弧菌基因組DNA的提取及16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增</p><p>　　參照張德民等的方法[20] 提取弧菌基因組DNA，并加以改進(jìn)：菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期離心收集菌體，用TE洗滌細(xì)胞，重懸于TE中，加溶菌酶0-2 mg/ mL，37 ℃水浴處理5-30 min，加SDS至終濃度為2 % ，60 ℃水浴處理5-60 min，酚/氯仿/異戊醇抽提，氯仿/異戊醇再抽提，乙醇沉淀，溶于

24、去離子水中。采用細(xì)菌通用性引物對(duì)27f（AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG）和 1541r（ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT）[21]擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 約1400 bp的片段，并用于測(cè)序。采用50 μL PCR反應(yīng)體系，其組成為：0.2-1 μg基因組DNA，4 μmol·L- 1引物，200 μmol·L- 1 dNTPs，5 μL10×buffer，1 U

25、DNA聚合酶，補(bǔ)雙蒸水到50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；前10個(gè)循環(huán)為94 ℃ 1 min，65-60 ℃ l min，72 ℃ 30 s (其中每個(gè)循環(huán)后復(fù)性溫度下降0. 5 ℃)；后18個(gè)循環(huán)為94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30</p><p>　　1.6 弧菌16S rDNA序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析　</p><p>　　引物對(duì)(2

26、7f-1512r) PCR擴(kuò)增的16S rDNA產(chǎn)物用UNIQ-10柱式通用DNA純化試劑盒純化，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將所得序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為： GU132526，GU132530，GU132535等。用BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)，下載相關(guān)序列用Mega4.0軟件，再選擇其他幾株已知類(lèi)別的代表弧菌，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。</p><p><b>　　2 結(jié)果&

27、lt;/b></p><p><b>　　2.1弧菌數(shù)量比較</b></p><p>　　對(duì)三疣梭子蟹健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體中的弧菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)（表1），計(jì)算出其弧菌濃度，從表中可知，健康塘水體弧菌數(shù)量為1.85-2.35×102 cfu/mL，弧菌的平均數(shù)量為2.1×102 cfu/mL；病害塘水體弧菌數(shù)量為0.65-1.90×1

28、02 cfu/ mL，弧菌的平均數(shù)量為1.3×102 cfu/ mL。</p><p>　　從以上數(shù)據(jù)可以看出，病害塘養(yǎng)殖水體弧菌的樣本1與健康塘在同一數(shù)量級(jí)上，比健康塘養(yǎng)殖水體的數(shù)量略少；病害塘養(yǎng)殖水體弧菌的樣本2比健康塘少一個(gè)數(shù)量級(jí)，數(shù)量幾乎少了一半；從平均數(shù)來(lái)看，病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌平均數(shù)量1.3×102 cfu/mL與健康塘養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量2.1×102在同一數(shù)量級(jí)上，且病

29、害塘的弧菌數(shù)量比健康塘的弧菌數(shù)量?jī)H略少一些。</p><p>　　表1 三疣梭子蟹養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量（cfu/ml）</p><p>　　Tab.1 The number of vibrio in the rearing water （cfu/ml）</p><p>　　2.2 弧菌群落結(jié)構(gòu)多樣性</p><p>　　2.2.1 弧菌菌落類(lèi)型

30、多樣性比較</p><p>　　我們從三疣梭子蟹養(yǎng)殖健康塘和病害塘的養(yǎng)殖水體中olond124共分離弧菌42株，其中健康塘水樣與病害塘水樣各21株，首先對(duì)其進(jìn)

31、行劃線純化，經(jīng)3-5天培養(yǎng)后，記錄其菌落形態(tài)并統(tǒng)計(jì)歸類(lèi)。根據(jù)弧菌菌落特征的差異（如表面形態(tài)、形態(tài)、質(zhì)地、顏色等）將弧菌菌落初步劃分為5個(gè)類(lèi)型（C1-C5）（見(jiàn)表2）。</p><p>　　從整體上來(lái)看，其中C1類(lèi)型為最優(yōu)勢(shì)類(lèi)型，共有18株菌，占分離菌株總數(shù)的42.9%，在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中分別有6、12株菌；其次是C2類(lèi)型，共有12株菌，占分離菌株總數(shù)的28.6%，在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中

32、分別有7、5株菌；第三是C4類(lèi)型，共10株，占分離菌株總數(shù)的23.8%，在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中分別有6、4株菌；另外，C2和C5類(lèi)型的菌株較少，均只有1株菌，均占分離菌株總數(shù)的2.4%，僅分布于健康塘養(yǎng)殖水體中。</p><p>　　分別從健康塘和病害塘養(yǎng)殖塘水體的數(shù)據(jù)可以看出，健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體均有21株弧菌，健康塘養(yǎng)殖水體的弧菌菌落分布在5個(gè)類(lèi)型中，其中C2（凸起、奶油、圓、墨綠）有7

33、株菌，為第一優(yōu)勢(shì)類(lèi)型；其次，C1（凸起、奶油、圓、橙黃）和C4（平展、奶油、圓、橙黃）均有6株，為第二優(yōu)勢(shì)類(lèi)型，且僅比第一優(yōu)勢(shì)類(lèi)型相差一株；另外，C3（凸起、蠟狀、圓、墨綠）和C5（平展、蠟狀、圓、橙黃）各一株。病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌菌落類(lèi)型僅分布在3個(gè)類(lèi)型中，比健康塘少了兩個(gè)，其中C1（凸起、奶油、圓、橙黃）有12株，為第一優(yōu)勢(shì)類(lèi)型，且數(shù)量上占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；其次，C2（凸起、奶油、圓、墨綠）有5株，為第二優(yōu)勢(shì)類(lèi)型，與第一優(yōu)勢(shì)菌相差7株；另

34、外，C4（平展、奶油、圓、橙黃）有4株。</p><p>　　首先，從健康塘和病害塘的弧菌菌落類(lèi)型多樣性比較可知，健康塘水體的弧菌分布在5個(gè)類(lèi)型中，較病害塘的弧菌分布要廣，健康塘的弧菌主要集中分布在C1、C2和C4這3個(gè)類(lèi)型，第一優(yōu)勢(shì)類(lèi)型為C2，分布比較均勻；病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌分布在3個(gè)類(lèi)型中，主要集中分布在C1類(lèi)型，C1類(lèi)型占了病害塘養(yǎng)殖水體分離菌的57.1%，占了病害塘弧菌的一半多，較另外兩個(gè)弧菌菌種具有明

35、顯的優(yōu)勢(shì)，從這一點(diǎn)可知病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌分布相對(duì)比較集中，與健康塘養(yǎng)殖水體不同。</p><p>　　另外，兩者也有共同之處，健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的共有類(lèi)型有3個(gè)，分別為C1、C2和C4。從各群落類(lèi)型的數(shù)量可以看出，健康塘養(yǎng)殖水體的這3個(gè)類(lèi)型集中了90.5%的弧菌數(shù)量，病害塘養(yǎng)殖水體則集中了全部的弧菌數(shù)量，從這一點(diǎn)來(lái)看具有相似性。</p><p>　　表2 三疣梭子蟹養(yǎng)殖水體的弧菌菌落

36、類(lèi)型分布</p><p>　　Tab.2 The colony category of the vibrio in the rearing water </p><p>　　2.2.2 弧菌種屬分布多樣性比較</p><p>　　我們對(duì)分離的弧菌進(jìn)行16S rDNA鑒定，健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體共分離了42株弧菌，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡5株，DNA提取失敗2株，未鑒定

37、成功2株，實(shí)際鑒定33株，16S rDNA序列Blast比對(duì)表明33株弧菌歸屬于6個(gè)種（98 %的序列相似性作為種的劃分標(biāo)準(zhǔn)）（表3），取該6個(gè)種類(lèi)的代表性菌株和其他6株非代表性菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1），比較弧菌種屬在各養(yǎng)殖水體中的分布。</p><p>　　從整體上看，在這6個(gè)種類(lèi)中，V.alginolyticus為最優(yōu)勢(shì)種，共有15株菌，占測(cè)序弧菌總數(shù)的44.5%，將近一半，其中健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘

38、養(yǎng)殖水體分別有6、9株菌；第二優(yōu)勢(shì)種為V.harveyi，共有7株菌，占測(cè)序弧菌總數(shù)的21.2 %，其中健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體分別為3、4株菌；第三優(yōu)勢(shì)種為V.campbellii和V.natriegens，均有4株菌，均占測(cè)序弧菌總數(shù)的12.1 %，其中V.campbellii在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中分別有3、1株菌，V.natriegens在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中則均為兩株；其余兩種菌V.neptuniu

39、s和V.xuii的數(shù)量相對(duì)較少，僅分布在個(gè)別樣品中，為1-2株。</p><p>　　分別從健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的數(shù)據(jù)可以看出，健康塘養(yǎng)殖水體的弧菌共有16株，5個(gè)種，其中V.alginolyticus有6株，為第一優(yōu)勢(shì)種，V.harveyi有4株，為第二優(yōu)勢(shì)種，V.campbellii有3株，為第三優(yōu)勢(shì)種，其余的兩個(gè)種有1-2株菌，數(shù)量上分布比較均勻；病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌共有17株，6個(gè)種，其中V.algin

40、olyticus有9株，，為第一優(yōu)勢(shì)種， V.harveyi有3株，為第二優(yōu)勢(shì)種，其余4種菌各有1-2株，數(shù)量分布上相對(duì)與健康塘來(lái)說(shuō)比較集中，V.alginolyticus的數(shù)量超過(guò)病害塘測(cè)序弧菌的一半，占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。</p><p>　　從健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌種屬多樣性比較來(lái)看，健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體的差異不是很大，有5個(gè)種（V.alginolyticus、V.campbellii、V.harv

41、eyi、V.natriegens和V.neptunius）為兩者所共有，其中V.alginolyticus為健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體的共有優(yōu)勢(shì)種，分別有6、9株菌，占各自塘的測(cè)序弧菌總數(shù)的比例為37.5 %、52.9 %，第二優(yōu)勢(shì)菌都為V.harveyi，其余3個(gè)種在兩塘中的數(shù)量差異也很小。</p><p>　　但是健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌種屬分布也有不同之處，病害塘弧菌的分布中第一優(yōu)勢(shì)菌為占了一半多的

42、菌種，其數(shù)量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，分布比較集中，而健康塘的弧菌分布相對(duì)比較均勻，這一現(xiàn)象與菌落的類(lèi)型分布特點(diǎn)相似。另外，有1株菌V.xuii僅在病害塘養(yǎng)殖水體出現(xiàn)。</p><p>　　表3 三疣梭子蟹養(yǎng)殖水體弧菌種屬分布</p><p>　　Tab.3 The species distribution of the vibrio in the rearing water</p>&

43、lt;p>　　圖1 三疣梭子蟹養(yǎng)殖水體代表菌株及部分其他非代表弧菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析</p><p>　　Fig.1 The phylogenetic analysis of the vibrio in the rearing water and some others</p><p>　　注： 包含的菌株為本實(shí)驗(yàn)從養(yǎng)殖塘分離鑒定的弧菌各菌種的代表菌株，其余為部分其

44、他非代表性弧菌菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　弧菌是海水環(huán)境中的常在菌群，廣泛分布在自然海區(qū)，是一種條件致病菌，當(dāng)養(yǎng)殖動(dòng)物受傷、體弱、抗病力降低和環(huán)境條件惡化時(shí)，環(huán)境中的部分致病性弧菌就會(huì)乘虛而入，引起蟹、蝦等各種水產(chǎn)動(dòng)物的疾病，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡。本文從弧菌的菌落計(jì)數(shù)出發(fā)，通過(guò)菌落特征的觀察和弧菌種屬多樣性序比較，對(duì)三

45、疣梭子蟹養(yǎng)殖健康塘和病害塘水體的弧菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較研究，意在通過(guò)兩者的比較，找出養(yǎng)殖塘弧菌群落結(jié)構(gòu)與發(fā)病的關(guān)系。</p><p>　　3.1 養(yǎng)殖水體弧菌群落結(jié)構(gòu)與病害的關(guān)系</p><p>　　研究證明，大部分病原體在致病前都是處在一種代謝繁殖不活躍或十分不活躍狀態(tài)，疾病的爆發(fā)，是因?yàn)椴≡w數(shù)量激劇增加、病原體的致病力大大加強(qiáng)[22]，本文也證實(shí)了這一情況。 V.alginolyti

46、cus為致病性弧菌[23]，在三疣梭子蟹健康塘和病害塘的養(yǎng)殖水體中都存在，并且在病害塘中數(shù)量有較多的增加，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，這可能是引發(fā)三疣梭子蟹疾病的原因之一，另外，菌落分布的結(jié)果也有類(lèi)似現(xiàn)象，病害塘的弧菌種類(lèi)減少，并且C1（凸起、奶油、圓、橙黃）數(shù)量較健康塘大大增加，成為了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類(lèi)型?？偠灾?，就是說(shuō)在正常情況下，養(yǎng)殖水體中弧菌的種類(lèi)分布比較均勻，各致病性和非致病性弧菌之間可能存在某種平衡，當(dāng)這個(gè)平衡被打破時(shí)，某種或某些致病性弧菌

47、大量繁殖，這些致病性弧菌就比較容易侵入蟹體內(nèi)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。</p><p>　　弧菌可分為致病性弧菌和非致病性弧菌，且絕大多數(shù)種類(lèi)為非致病性弧菌，目前已確定的主要的致病性弧菌僅包括霍亂弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌在內(nèi)的約10種左右[23]，從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出，健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌在數(shù)量上差別不大，病害塘比健康塘稍微少一些；兩者的弧菌菌落類(lèi)型分布方面有些差異，健康塘分布比較均勻，而病害塘的弧菌分

48、布比較集中在C1類(lèi)型；另外，兩者在種屬分布方面的特點(diǎn)與菌落分布相似。因此我們可以推斷，弧菌發(fā)病與養(yǎng)殖水體中弧菌群落結(jié)構(gòu)的變化有直接關(guān)系，弧菌數(shù)量有集中到某些致病菌的趨勢(shì)，使這些致病菌處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，從而比較容易侵入蟹體，引起三疣梭子蟹的疾病。</p><p>　　3.2 菌落類(lèi)型與種屬分布的聯(lián)系</p><p>　　從表4可知，雖然同一種弧菌的菌落特征不是完全分布于同一菌落類(lèi)型，如V.

49、alginolyticus分布于C1，C2，C4三個(gè)類(lèi)型，V. harveyi分布于C1，C2，C4三個(gè)類(lèi)型。但是每種弧菌都有各自的優(yōu)勢(shì)菌落類(lèi)型，如V. alginolyticus和V. natriegens的優(yōu)勢(shì)菌落類(lèi)型均為C1，分別占各自種屬總菌株數(shù)的80.0 %和75.0 %；另外，V.campbellii有3株菌分布于C2類(lèi)型，占該種總菌株數(shù)的75.0 % ，V. harveyi的7株菌各有3株分布在C2和C4類(lèi)型，各占該種總菌

50、數(shù)的42.9 % 從這些結(jié)果我們可知，V. alginolyticus的菌落形態(tài)主要為凸起、奶油、圓、橙黃， V.campbellii的菌落形態(tài)主要為凸起、奶油、圓、墨綠，V. natriegens的菌落形態(tài)主要為凸起、奶油、圓、橙黃，V. harveyi的菌落形態(tài)主要為凸起、奶油、圓、墨綠和平展、奶油、圓、橙黃，V. harveyi的種內(nèi)差別較大，發(fā)育型較多，可能是因?yàn)檫@個(gè)原因，所以菌落形態(tài)比較豐富，但具體是由于什么原因，有待進(jìn)一步實(shí)

51、驗(yàn)驗(yàn)證。</p><p>　　從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可知，養(yǎng)殖水體的弧菌菌落類(lèi)型中，C1（凸起、奶油、圓、橙黃）為第一優(yōu)勢(shì)種群，C2（凸起、奶油、圓、墨綠）為第二優(yōu)勢(shì)種群，表4根據(jù)測(cè)序弧菌所統(tǒng)計(jì)的菌落類(lèi)型結(jié)果顯示也是如此，從該現(xiàn)象我們可以推測(cè)，弧菌種屬分布與弧菌菌落類(lèi)型分布基本一致。我們可以通過(guò)菌落類(lèi)型分布簡(jiǎn)單的分析弧菌的群落結(jié)構(gòu)，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供一些參考依據(jù)。</p><p>　　表4 弧菌

52、種屬分布的群落特征</p><p>　　Tab.4 The colony characteristics of different vibro species</p><p>　　3.3 弧菌的培養(yǎng)特性及其對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響</p><p>　　通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我們還發(fā)現(xiàn)一個(gè)現(xiàn)象，就是弧菌不容易在TCBS瓊脂平板上長(zhǎng)期存活，我們分離得到的42株弧菌，在20天后對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)接

53、保種，結(jié)果42株弧菌中有20株轉(zhuǎn)接失敗，對(duì)失敗的弧菌再次進(jìn)行轉(zhuǎn)接，結(jié)果仍然未成功，死亡率有47.6 % ；之后對(duì)剩下的22株弧菌，10天后進(jìn)行轉(zhuǎn)接，結(jié)果轉(zhuǎn)接成功21株，失敗1株，死亡率為4.5 %；之后對(duì)剩下的21株弧菌，15天后進(jìn)行轉(zhuǎn)接，結(jié)果轉(zhuǎn)接成功19株，失敗2株，死亡率為9.5 % 一般細(xì)菌在培養(yǎng)基上的保存時(shí)間為兩個(gè)月左右，有些細(xì)菌如芽孢桿菌可以保存3個(gè)月左右，可是弧菌在TCBS培養(yǎng)基上的保存時(shí)間卻非常短，20天后轉(zhuǎn)接的死亡率即將

54、近一半，從之后的2次轉(zhuǎn)接記錄我們可以看出，我們應(yīng)該在10-15天內(nèi)就對(duì)弧菌進(jìn)行轉(zhuǎn)接，這期間死亡率低于10 % ，最好是在10天左右就轉(zhuǎn)接，死亡率可能會(huì)小于5 %</p><p>　　分離的42株弧菌中，由于死亡的弧菌較多，可能會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中有5株弧菌的死亡導(dǎo)致無(wú)法測(cè)序，從而無(wú)法鑒定它們的系統(tǒng)發(fā)育地位，另外DNA提取失敗2株，未鑒定成功2株，這使得弧菌種屬多樣性的數(shù)據(jù)有些缺陷。這可能是導(dǎo)致健康塘和病害塘養(yǎng)殖

55、水體的弧菌多樣性差異不大的原因之一。另外，由于時(shí)間和資源的局限，該實(shí)驗(yàn)分離純化的弧菌數(shù)量不多，這也有可能導(dǎo)致健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌種類(lèi)多樣性的差異不太明顯。</p><p>　　總而言之，從該實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)來(lái)看，健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌群落結(jié)構(gòu)，它們本身的差異不大，不過(guò)病害塘的種類(lèi)分布較健康塘的要集中，第一優(yōu)勢(shì)種群也較健康塘的不同。至于弧菌的培養(yǎng)特性和分析的弧菌數(shù)量是否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生了影響，就有待進(jìn)一步的研

56、究表明了。</p><p><b>　　4 展望</b></p><p>　　從吳建平等的文章[24]中可知，大亞灣海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)域弧菌的數(shù)量和種類(lèi)呈明顯的季節(jié)性變化，弧菌數(shù)量從5月份開(kāi)始逐漸增多，8月份達(dá)到最高值，11月份后又開(kāi)始減少并趨于穩(wěn)定；弧菌的種類(lèi)也有季節(jié)變化，比如溶藻弧菌較多出現(xiàn)在6-11月，尤其是8-10月，副溶血弧菌較多出現(xiàn)在5-9月。這可能與環(huán)境中可

57、利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和理化因子有關(guān)，這些往往是影響細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的因素，也可直接影響?zhàn)B殖動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，不同的季節(jié)有不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和理化因子的組成，不同的弧菌種類(lèi)對(duì)其的適應(yīng)性不同，結(jié)果導(dǎo)致不同季節(jié)，弧菌的數(shù)量和種類(lèi)不同。由于采樣點(diǎn)和時(shí)間的限制，該實(shí)驗(yàn)僅分析了7月份的健康養(yǎng)殖水體和病害養(yǎng)殖水體的弧菌群落結(jié)構(gòu)比較，沒(méi)有進(jìn)行連續(xù)的群落演替研究。其次，該實(shí)驗(yàn)對(duì)采樣水體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和理化因子也未進(jìn)行深入的分析，因此也未能分析其與弧菌群落變化的關(guān)系。在這兩方

58、面深入研究，能使弧菌的群落結(jié)構(gòu)分析更完整更全面。另外，解決弧菌不易在TCBS培養(yǎng)基上長(zhǎng)期存活的問(wèn)題，增加實(shí)驗(yàn)分析的弧菌數(shù)量等也能提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 陳萍, 李吉濤, 李健, 劉淇, 劉萍. 溶藻弧菌對(duì)三疣梭子蟹抗氧化酶系統(tǒng)的影響, 海洋科學(xué). 2009, 33(5) : 59-63.<

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