三疣梭子蟹蛻皮周期中mih表達研究【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因的表達</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><

2、p>　　于近些年捕撈過度，梭子蟹自然資源也正日益減少，為滿足市場需求和適當保護資源，近年來沿海很多地方已開展人工養(yǎng)殖，人工養(yǎng)殖的三疣梭子蟹與其它的甲殼類動物一樣，存在性早熟和的問題。國內(nèi)外研究者對三疣梭子蟹內(nèi)分泌系統(tǒng)研究已趨于熱點，但是還不能有效的解決三疣梭子蟹養(yǎng)殖中普遍出現(xiàn)的性早熟和蛻皮未遂等難題（劉昌杰，1996，1999）。這些問題的發(fā)生可能與甲殼類動物蛻皮機制有關(guān)（姚俊杰等，2006）。在甲殼動物個體發(fā)育過程中，存在蛻皮現(xiàn)

3、象，即蛻去舊的外骨骼并長出新的外骨骼的過程。蛻皮是甲殼動物生長和發(fā)育的標志特征，它貫穿甲殼動物個體發(fā)育的始終，它受神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)。蛻皮周期可分為蛻皮(molt 或ecdysis) 、蛻皮后(postmolt 或metecdysis) 、蛻皮間期(intermolt 或anecdysis)和蛻皮前期(premolt 或proecdysis) ;對于甲殼動物,根據(jù)Drach 和Tchernigovtzeff（1967）的標準可

4、把蛻皮周期進一步劃分為蛻殼前期(Proeedysis stage，即D期，D0 - D4) 、蛻殼期(Molt stage，即E期)、</p><p>　　甲殼動物的個體發(fā)育伴隨有周期性的蛻皮過程，該過程受Y-器官分泌的蛻皮激素和蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)的正負調(diào)控。經(jīng)生化鑒定，MIH屬于甲殼動物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormon

5、e，CHH)家族神經(jīng)肽。CHH家族成員除了CHH、MIH外，還包括性腺抑制激素(gonad．inhibiting hormone，GIH)和大顎器官抑制激素(mandibular organ-inhibiting hormone，MOIH)。MIH在眼柄X-器官的表達量最高，其次在腦，而在其他組織中幾乎沒有表達。</p><p>　　蛻皮抑制激素基因在甲殼動物的生長、發(fā)育和繁殖調(diào)控中起著重要作用，其重組蛋白的表達

6、有助于詳細研究蛻皮抑制激素基因在甲殼動物中的調(diào)節(jié)機制。近年來一些研究結(jié)果表明，蛻皮周期是由一個非常復雜的系統(tǒng)來調(diào)控的。Nakatsuii and sonobe(2003，2004)在對美洲螯蝦Procambarus clarkii的MIH研究中發(fā)現(xiàn)，蛻皮周期中MIH的水平與蛻皮激素的水平并非呈現(xiàn)絕對的負相關(guān)。在整個蛻皮周期中，MIH水平只在蛻皮前期減少。另外，蛻皮周期不僅與MIH 的水平有關(guān)，還與Y-器官對MIH的應答性的大小有密切聯(lián)系

7、。</p><p>　　顧志敏等（1991）發(fā)現(xiàn)切除眼柄可以縮短蛻皮周期，促進蛻皮發(fā)身。Okumura等(2005）對日本囊對蝦的研究表明，通過在蛻皮間期注射具有生物活性的重組MIH蛋白之后，日本囊對蝦的蛻皮間期由（9.0±0.4）d延長到（9.5±0.5）d，并且血淋巴中蛻皮激素的含量從（1.94±1.09）ng下降至（1.28±0.39）ng。這一結(jié)果表明，MIH可以延

8、長日本囊對蝦的蛻皮間期，從而對日本囊對蝦的蛻皮調(diào)控產(chǎn)生抑制作用。Lee（2007）對紅陸蟹（Gecarcinus lateralis）的研究同樣表明，經(jīng)原核表達的MIH蛋白能對蛻皮過程產(chǎn)生抑制作用，從而對其蛻皮調(diào)控產(chǎn)生影響。Kara J. Lee等（1998）用Northen blot方法對可口美青蟹蛻皮周期中MIH mRNA水平變化進行了測定分析，發(fā)現(xiàn)在蛻皮前期MIH的mRNA水平逐漸降低，蛻皮以后MIH的水平突然升高，在蛻皮期間持續(xù)

9、升高，這在mRNA水平證實了MIH的生理功能。</p><p>　　另外對與三疣梭子蟹蛻皮周期中的MIH表達水平與蛻皮周期各個時期關(guān)系從未報道。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　1．樣品采集，主要對三疣梭子蟹蛻皮周期中各個時期的MIH樣品采集。</p><p>　　2. 對三疣梭子蟹MIH基因的

10、mRNA提取以及定量反轉(zhuǎn)錄成cDNA。</p><p>　　3．設(shè)計三疣梭子蟹MIH的cDNA特異性引物，對公布的甲殼類動物18S RNA 的cDNA序列的比對分析，設(shè)計一對兼并引物擴增一段保守的cDNA片段作為內(nèi)參。</p><p>　　4. real time PCR分析蛻皮周期中各個時期與MIH水平變化的關(guān)系。</p><p>　　擬解決的關(guān)建技術(shù)和難點：&l

11、t;/p><p>　　1、三疣梭子蟹蛻皮周期中各個時期的樣品采集。</p><p>　　2、得到高質(zhì)量的眼柄X器-竇腺復合體RNA。</p><p>　　3、通過實驗得到蛻皮周期中各個時期MIH表達量，以及相對的變化趨勢。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　四、研究的總體安排與進度：<

12、;/p><p>　　2010.10 畢業(yè)論文選題；</p><p>　　2010.10-2010.11 進行文獻查閱和資料收集，.完成開題報告及任務書，制定具體研究計劃和試驗方案；</p><p>　　2010.12 開題答辯與綜述；</p><p>　　2010.12-2011.02 各方面實驗的進行；</p><p>

13、　　2011.02-2011.03數(shù)據(jù)處理和材料整理、分析；</p><p>　　2011.03-2011.05完成2篇外文文獻翻譯、論文撰寫、提交并答辯。</p><p><b>　　四、參考文獻</b></p><p>　　[1] 顧志敏，何林崗．切除單側(cè)眼柄對中華絨螯蟹蛻殼、生長、成熟的影響[J]．淡水漁業(yè)，1991，5：10-13．&l

14、t;/p><p>　　[2] 劉昌杰，侯艷麗，王緯等．蝦池養(yǎng)殖三疣梭子蟹當年性早熟初報[J]．齊魯漁業(yè)，1996，16（6）：19-20．</p><p>　　[3] 邱高峰, 張愛萍, 樓允東等.鋸緣青蟹蛻皮抑制激素cDNA的分子克隆及其表達分析[J]．水產(chǎn)學報，2003，27（3）：207-212．</p><p>　　[4] 姚俊杰，趙云龍． 甲殼動物蛻皮的調(diào)節(jié)機

15、制研究進展[J]． 水利漁業(yè)，2006，26（6）8-10．</p><p>　　[5] 朱冬發(fā)，沈建明，楊濟芬等．三疣梭子蟹蛻皮抑制激素cDNA的克隆與序列分析[J]．動物學報，2008，54（6）：1112-1118．</p><p>　　[6] 元一舟, 朱冬發(fā), 楊濟芬等.甲殼動物蛻皮抑制激素調(diào)控機制的研究進展.動物學雜志[J], 2010, 45(2):165-170.</

16、p><p>　　[7] 郭豫杰， 周開亞，馬長艷．中華絨熬蟹蛻皮抑制激素1（Ers-M1H1）-GST融合白在大腸桿菌中的表達[J]． 中國水產(chǎn)科學， 2004，01（21）：123-127．</p><p>　　[8] 朱小明，李少菁．甲殼動物幼體蛻皮的調(diào)控[J]． 水產(chǎn)學報，2001，25（4）：56-59．</p><p>　　[9] 趙紅霞．甲殼動物蛻皮調(diào)控研究

17、及蛻殼素的使用[J]． 廣東飼料， 2006， 15（1）：154-159．</p><p>　　[10] Spaziani E, Watson RD, Mattson MP, et al.. Ecdysteriod biosynthesis in the crustacean Y-organ and control by an eyestalk neuropeptide[J]. Exp. Zool., 1989

18、,252(3):271-282.</p><p>　　[11] Chang E S, Prestwich G D, Bruce M J. Amin. acid sequence of a peptide with both molt-inhibiting and hyperglycemic activities in the lobster Homarus americanus[J]. Biochem. Biop

19、hys. Res. Comm., 1990,171(2):818-826.</p><p>　　[12] Drach P, Tchernig C. Sur la methode de determination des stades d’intermue eosin application generale aux Crustaces[J]. Vie et Milieu, Serie A, Biologie Ma

20、rine, 1967,18:595-610.</p><p>　　[13] Keller R, Crustacean neuropeptides: structures, functions and comparative aspects[J]. Experiential, 1992,42:439-448.</p><p>　　[14] kumura T, hira T, Katayama

21、 H, et al.. In vivo effects of a recombinant molt-inhibiting hormone on molt interval and hemolymph ecdysteroid level in the Kuruma Prawn, Marsupenaeus japonicus. Zoological Science[J] ,2005,22:317-320.</p><p&

22、gt;　　[15] Lee K J, Kim H W. Molt-inhibiting hormone from the tropical land crab, Gecarcinus lateralis, cloning, tissue expression, and expression of biologically active recombinant peptide in yeast[J]. Gen Comp Endocrino

23、l, 2007, 150(3): 505-513.</p><p>　　[16] Nakatsuji, T., Sonobe, H.. Measurement of molt-inhibiting hormone titer in hemolymph of the American crayfish, Procambarus clarkii, by time-resolved fluoroimmun. assay

24、[J]. Zool. Sci., 2003, 20: 999–1001.</p><p>　　[17] hira T., Katayama H., Tominaga S.. Cloning and characterization of a molt-inhibiting hormone-like peptide from the prawn Marsupenaeus japonicus[J]. Peptides

25、, 2005,26: 259–268.</p><p>　　[18] hira T , Nishimura T , Sonobe H ,et al.. Expression of recombinant molt-inhibiting hormone of the Kuruma prawn Penaeus japonicus in Escherichia coli[J]. Bio. sci. Bio. techn

26、ol. Bio. chem. 1999,63:1576-1581.</p><p>　　[19] hira T, Watanabe T, Nagasawa H, et al.. Molecular cloning of a molt-inhibiting hormone from the kuruma prawn Penaeus japonicus[J]. Biological Science,1997,14:7

27、85-789.</p><p>　　[20] Skinner, D. M.. Molting and regeneration. In Bliss, DoE., Mantel,L.H. (Eds.)[J], The Biology of Crustacea. Academic Press, New York, 1985:pp.43-146.</p><p>　　[21] Spaziani

28、E, Watson RD, Mattson MP, et al.. Ecdysteriod biosynthesis in the crustacean Y-organ and control by an eyestalk neuropeptide[J]. Exp.Zool., 1989,252(3):271-282.</p><p>　　[22] Umphrey, H. R., Lee, K.J., Watso

29、n, R.D., et al.. Molecular cloning of a cDNA encoding molt-inhibiting hormone of the crab,　Cancer magister[J].　Mole.　Cell. End. crinolo, 1998,136:145-149.</p><p>　　[23] Webster, S.G., Amin. acid sequence of

30、putative molt-inhibiting hormone from the crab Carcinus maenas[J]. Proc. Biol. Sci., 1991,244:247–252.</p><p>　　[24] Weidemann W, Gromoll J , Keller R. Cloning and sequence analysis of cDNA for precursor of

31、a crustacean hyperglycemic hormone[J]. FEBS Lett, 1989,257(01):31-34.</p><p>　　[25] Yang WJ, Aida K, Nagasawa H, Amin. acid sequences of a hyperglycemic hormone and its related peptides from the kuruma prawn

32、, Penaeus japonicus[J]. Aquaculture, 1995,135:205-212.</p><p>　　[26] Yang W.J., Aida K., Terauchi A., et al.. Amin. acid sequence of a peptide with molt-inihibiting activity from the kuruma prawn Penaeus jap

33、onicus[J]. Peptides, 1996,17:197-202.</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　食品科學與工程</b></p><p>　　蛻皮抑制激素（MIH）的研究進展</p><p>　　摘要：蛻皮現(xiàn)象一直伴隨著甲殼動物的整個周期，

34、經(jīng)研究表明在甲殼動物的蛻皮周期中,MIH基因起著重要的作用。三疣梭子蟹在國內(nèi)研究涉及的比較少，因此我們計劃特別針對MIH基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達做詳細的了解，以明確其表達的機制。</p><p>　　關(guān)鍵詞：三疣梭子蟹；蛻皮抑制激素；MIH ；表達 ；甲殼動物</p><p>　　三疣梭子蟹[Portunus trituberculatus（Miers）]隸屬于軟甲綱、十足目、梭子

35、蟹科、梭子蟹屬，是一種大型海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類，主要分布于中國、朝鮮、日本等海域，沿海人工養(yǎng)殖的一種重要經(jīng)濟動物。由于近些年捕撈過度，梭子蟹自然資源也正日益減少，為滿足市場需求和適當保護資源，近年來沿海很多地方已開展人工養(yǎng)殖，人工養(yǎng)殖的三疣梭子蟹與其它的甲殼類動物一樣，存在性早熟和的問題。國內(nèi)外研究者對三疣梭子蟹內(nèi)分泌系統(tǒng)研究已趨于熱點，但是還不能有效的解決三疣梭子蟹養(yǎng)殖中普遍出現(xiàn)的性早熟和蛻皮未遂等難題（劉昌杰，1996，1999）。這些問題

36、的發(fā)生可能與甲殼類動物蛻皮機制有關(guān)（姚俊杰等，2006）。甲殼動物的蛻皮是由位于眼柄的X器-竇腺復合體分泌的蛻皮抑制激素（molt-inhibiting hormone，MIH）通過調(diào)節(jié)Y-器官蛻皮激素的合成間接控制蛻皮的發(fā)生（Spaziani等，1989；Chang等，1990），三疣梭子蟹的蛻皮與MIH存在著重要的聯(lián)系，因此對三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因表達的研究將有助于了解在三疣梭子蟹養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的性早熟和蛻皮未遂的現(xiàn)象。&l

37、t;/p><p>　　1 三疣梭子蟹蛻周期具體情況</p><p>　　甲殼動物個體發(fā)育過程中，存在蛻皮現(xiàn)象，即蛻去舊的外骨骼并長出新的外骨骼的過程。蛻皮是甲殼動物生長和發(fā)育的標志特征，它貫穿甲殼動物個體發(fā)育的始終，它受神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)。蛻皮周期可分為蛻皮(molt 或ecdysis) 、蛻皮后(postmolt 或metecdysis) 、蛻皮間期(intermolt 或anec

38、dysis)和蛻皮前期(premolt 或proecdysis) ;對于甲殼動物,根據(jù)Drach 和Tchernigovtzeff（1967）的標準可把蛻皮周期進一步劃分為蛻殼前期(Proeedysis stage，即D期，D0 - D4) 、蛻殼期(Molt stage，即E期)、軟殼期(Soft-shelled stage，即A期)、薄殼期(Papershell stage，即B期) 、硬殼期(Hard stage，即c期，C1 -

39、 C4) 5 個時相。</p><p>　　2 蛻皮周期機理研究</p><p>　　甲殼動物的個體發(fā)育伴隨有周期性的蛻皮過程，該過程受Y-器官分泌的蛻皮激素和蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)的正負調(diào)控。經(jīng)生化鑒定，MIH屬于甲殼動物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)家族神經(jīng)肽。CHH家族成員除了CH

40、H、MIH外，還包括性腺抑制激素(gonad．inhibiting hormone，GIH)和大顎器官抑制激素(mandibular organ-inhibiting hormone，MOIH)。MIH在眼柄X-器官的表達量最高，其次在腦，而在其他組織中幾乎沒有表達。</p><p>　　蛻皮抑制激素基因在甲殼動物的生長、發(fā)育和繁殖調(diào)控中起著重要作用，其重組蛋白的表達有助于詳細研究蛻皮抑制激素基因在甲殼動物中的調(diào)

41、節(jié)機制。近年來一些研究結(jié)果表明，蛻皮周期是由一個非常復雜的系統(tǒng)來調(diào)控的。Nakatsuii and sonobe(2003，2004)在對美洲螯蝦Procambarus clarkii的MIH研究中發(fā)現(xiàn)，蛻皮周期中MIH的水平與蛻皮激素的水平并非呈現(xiàn)絕對的負相關(guān)。在整個蛻皮周期中，MIH水平只在蛻皮前期減少。另外，蛻皮周期不僅與MIH 的水平有關(guān)，還與Y-器官對MIH的應答性的大小有密切聯(lián)系。</p><p>&

42、lt;b>　　3 MIH基因研究</b></p><p>　　3．1 MIH基因特征</p><p>　　MIH屬于甲殼動物所特有的甲殼動物高血糖激素（crustacean hyperglycemic hormone，CHH）家族神經(jīng)肽，除MIH，CHH家族還包括CHH，性腺抑制激素（gonad-inhibiting hormone，GIH)和大顎器官抑制激素（mandi

43、bular organ-inhibiting hormone,MOIH）(Keller,1992)。MIH組前體是由信號肽和成熟肽組成（Weidemann，1989）。從已得到的甲殼類動物MIH序列分析可知，這些MIH的成熟肽由74-78個氨基酸殘基組成并且具有6個位置保守的半胱氨酸（Cys）殘基（Webster,1991；Chung等,1996；Marco等，2000；Chen等，2007，朱冬發(fā)等，2008）。</p>

44、<p>　　MIH是在甲殼動物的眼柄中的X-器官中合成，并在神經(jīng)血器官即竇腺（sinus gland ，SG）中貯存和釋放（Skinner等，1985；Lachaise等，1993），顧志敏（1991）從對MIH的研究發(fā)現(xiàn)，在切除甲殼類動物眼柄后就能有效的促進蛻殼和性腺的早期發(fā)育，而對切除眼柄的動物重新注入眼柄分泌物或合成的MIH后，蛻皮激素濃度就會降低，同時蛻皮也會推遲，所以都普遍認為甲殼動物的蛻皮的發(fā)生和調(diào)控與MIH 分

45、泌量有關(guān)，只有當MIH的分泌量減少或停止時蛻皮才會發(fā)生（Bruce等，1984；Nakatsuji等，2004）。但是Nakatsuji和Sonnobe（2004）在研究克氏螯蝦（Procambarus clarkii）卻發(fā)現(xiàn)了不同的情況，MIH的表達量在蛻皮前期的中期和后期都增加了，而蛻皮激素的表達量卻同樣增加。</p><p>　　目前據(jù)報道已得到三疣梭子蟹MIH基因的克隆，其cDNA序列包含210 bp的5

46、端非編碼區(qū)、342 bp的編碼區(qū)和1020 bp的3 端非編碼區(qū)。編碼區(qū)用Signal 3.0 Server預測，得到了由35個氨基酸殘基組成的信號肽序列。3 端非編碼區(qū)包含一個保守的加尾信號(AATAAA)，距離下游的Poly (A)12 bp。編碼區(qū)序列編碼113個氨基酸，包括35個氨基酸組成的信號肽和78個氨基酸組成的成熟肽。成熟肽含有6個位置保守的Cys殘基和1個Glu殘基，這與CHH家族的Ⅱ組特征相符。</p>

47、<p>　　MIH氨基酸組成具有種間多態(tài)性，已知的短尾類(蟹類)由78個氨基酸殘基組成，而對蝦類和螯蝦類的數(shù)目種間差異較大。日本對蝦和刀額新對蝦的MIH由77個氨基酸組成，南美白對蝦的MIH 僅為72個，克氏原螯蝦的則為75個氨基酸。序列分析表明，mRNA種間多態(tài)性是由于缺失了近C’端的幾個酸殘基所致，C’末端的氨基酸序列的保守性較差，推測MIH在體內(nèi)有多種不同的構(gòu)型。</p><p>　　3.2 M

48、IH基因有關(guān)研究和最新概況</p><p>　　目前，國內(nèi)外對甲殼類動物MIH研究主要集中在對MIH基因的獲取及表達，已經(jīng)得到了美洲黃道蟹 (Cancer magister)（Umphrey等，1998）、可口美青蟹( Callinectes sapidus)(Lee等，1995) 、三葉真蟹(Carcinus maenas)（Klein等，1993）、斑紋蟳(Charybdis feriatus)（Chan等，

49、1998）、日本對蝦（Marsupenaeus japonicus）（Ohira等，1997）、刀額新對蝦（Metapenaeus ensis)（Gu等，1998）、中國對蝦（Fennropenaeus chinens）（王在照等，2003）和鋸緣青蟹（Scylla serrata）（邱高峰等，2003）三疣梭子蟹等（Portunus trituberculatus）（朱冬發(fā)等，2008）MIH基因的cDNA全長序列。</p>

50、;<p>　　但是很少研究甲殼動物蛻皮周期中MIH表達量變化關(guān)系。顧志敏等（1991）發(fā)現(xiàn)切除眼柄可以縮短蛻皮周期，促進蛻皮發(fā)身。Okumura等(2005）對日本囊對蝦的研究表明，通過在蛻皮間期注射具有生物活性的重組MIH蛋白之后，日本囊對蝦的蛻皮間期由（9.0±0.4）d延長到（9.5±0.5）d，并且血淋巴中蛻皮激素的含量從（1.94±1.09）ng下降至（1.28±0.39）

51、ng。這一結(jié)果表明，MIH可以延長日本囊對蝦的蛻皮間期，從而對日本囊對蝦的蛻皮調(diào)控產(chǎn)生抑制作用。Lee（2007）對紅陸蟹（Gecarcinus lateralis）的研究同樣表明，經(jīng)原核表達的MIH蛋白能對蛻皮過程產(chǎn)生抑制作用，從而對其蛻皮調(diào)控產(chǎn)生影響。Kara J. Lee等（1998）用Northen blot方法對可口美青蟹蛻皮周期中MIH mRNA水平變化進行了測定分析，發(fā)現(xiàn)在蛻皮前期MIH的mRNA水平逐漸降低，蛻皮以后MI

52、H的水平突然升高，在蛻皮期間持續(xù)升高，這在mRNA水平證實了MIH的生理功能。</p><p>　　另外對與三疣梭子蟹蛻皮周期中的MIH表達水平與蛻皮周期各個時期關(guān)系從未報道。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 顧志敏，何林崗．切除單側(cè)眼柄對中華絨螯蟹蛻殼、生長、成熟的影響[J]．淡水漁業(yè)，1991，5：

53、10-13．</p><p>　　[2] 劉昌杰，侯艷麗，王緯等．蝦池養(yǎng)殖三疣梭子蟹當年性早熟初報[J]．齊魯漁業(yè)，1996，16（6）：19-20．</p><p>　　[3] 邱高峰, 張愛萍, 樓允東等.鋸緣青蟹蛻皮抑制激素cDNA的分子克隆及其表達分析[J]．水產(chǎn)學報，2003，27（3）：207-212．</p><p>　　[4] 姚俊杰，趙云龍． 甲殼

54、動物蛻皮的調(diào)節(jié)機制研究進展[J]． 水利漁業(yè)，2006，26（6）8-10．</p><p>　　[5] 朱冬發(fā)，沈建明，楊濟芬等．三疣梭子蟹蛻皮抑制激素cDNA的克隆與序列分析[J]．動物學報，2008，54（6）：1112-1118．</p><p>　　[6] 元一舟, 朱冬發(fā), 楊濟芬等.甲殼動物蛻皮抑制激素調(diào)控機制的研究進展.動物學雜志[J], 2010, 45(2):165-1

55、70.</p><p>　　[7] 郭豫杰， 周開亞，馬長艷．中華絨熬蟹蛻皮抑制激素1（Ers-M1H1）-GST融合白在大腸桿菌中的表達[J]． 中國水產(chǎn)科學， 2004，01（21）：123-127．</p><p>　　[8] 朱小明，李少菁．甲殼動物幼體蛻皮的調(diào)控[J]． 水產(chǎn)學報，2001，25（4）：56-59．</p><p>　　[9] 趙紅霞．甲殼

56、動物蛻皮調(diào)控研究及蛻殼素的使用[J]． 廣東飼料， 2006， 15（1）：154-159．</p><p>　　[10] Spaziani E, Watson RD, Mattson MP, et al.. Ecdysteriod biosynthesis in the crustacean Y-organ and control by an eyestalk neuropeptide[J]. Exp. Zoo

57、l., 1989,252(3):271-282.</p><p>　　[11] Chang E S, Prestwich G D, Bruce M J. Amin. acid sequence of a peptide with both molt-inhibiting and hyperglycemic activities in the lobster Homarus americanus[J]. Bioch

58、em. Biophys. Res. Comm., 1990,171(2):818-826.</p><p>　　[12] Drach P, Tchernig C. Sur la methode de determination des stades d’intermue eosin application generale aux Crustaces[J]. Vie et Milieu, Serie A, Bio

59、logie Marine, 1967,18:595-610.</p><p>　　[13] Keller R, Crustacean neuropeptides: structures, functions and comparative aspects[J]. Experiential, 1992,42:439-448.</p><p>　　[14] kumura T, hira T,

60、Katayama H, et al.. In vivo effects of a recombinant molt-inhibiting hormone on molt interval and hemolymph ecdysteroid level in the Kuruma Prawn, Marsupenaeus japonicus. Zoological Science[J] ,2005,22:317-320.</p>

61、<p>　　[15] Lee K J, Kim H W. Molt-inhibiting hormone from the tropical land crab, Gecarcinus lateralis, cloning, tissue expression, and expression of biologically active recombinant peptide in yeast[J]. Gen Comp E

62、ndocrinol, 2007, 150(3): 505-513.</p><p>　　[16] Nakatsuji, T., Sonobe, H.. Measurement of molt-inhibiting hormone titer in hemolymph of the American crayfish, Procambarus clarkii, by time-resolved fluoroimmu

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64、eptides, 2005,26: 259–268.</p><p>　　[18] hira T , Nishimura T , Sonobe H ,et al.. Expression of recombinant molt-inhibiting hormone of the Kuruma prawn Penaeus japonicus in Escherichia coli[J]. Bio. sci. Bio

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71、a prawn, Penaeus japonicus[J]. Aquaculture, 1995,135:205-212.</p><p>　　[26] Yang W.J., Aida K., Terauchi A., et al.. Amin. acid sequence of a peptide with molt-inihibiting activity from the kuruma prawn Pena

72、eus japonicus[J]. Peptides, 1996,17:197-202.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH表達研究</p><p><b>　　目錄<

73、/b></p><p>　　三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因的表達錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　引言15</b></p><p><b>　　1材料與方法18</b></p><p><b>　　1.1 材料18</b></p>&l

74、t;p>　　1.2 主要試劑18</p><p><b>　　1.3 方法18</b></p><p>　　1.3.1 總RNA提取18</p><p>　　1.3.2 第一鏈cDNA合成18</p><p>　　1.3.4 熒光定量PCR18</p><p><b>　

75、　2 結(jié)果19</b></p><p><b>　　3．討論23</b></p><p>　　3.1 MIH的作用及其作用機制23</p><p>　　3.2 影響三疣梭子蟹蛻皮的各種因素研究24</p><p>　　3.2.1 激素24</p><p>　　3.2.2 能量

76、24</p><p>　　3.2.3 其他因素25</p><p><b>　　4.總結(jié)25</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻26</b></p><p>　　摘要：在本次研究中，以實時熒光定量PCR技術(shù)（qu

77、antitative real-time PCR, qRT-PCR）相對定量2 - △△Ct方法，對MIH基因表達出的mRNA進行檢測。實驗結(jié)果表明，隨三疣梭子蟹蛻皮周期進行，蛻皮周期中MIH表達水平變化呈一個明確變化的趨勢，從蛻后A期MIH表達量開始上升，直到蛻皮C期達到頂峰，然后慢慢下降到蛻前D3/D4期達到最低，完成一個蛻皮過程，然后進入下一個蛻皮周期。其中以蛻皮周期中的蛻前D0期為對照，采用2 - △△Ct方法計算另外各個蛻皮時

78、期MIH基因mRNA的相對表達量。2 - △△Ct 結(jié)果表示，MIH基因在蛻皮周期中的表達情況，相對對照組蛻前D0期表達量，蛻后A期為0.42±0.08倍，蛻后B期為1.09±0.09倍，蛻皮C期為1.35±0.16倍，蛻前D1期0.78±0.07倍，蛻前D2期為0.27±0.08倍，蛻前D3/4期為0.20±0.04倍。三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因表達量的變化差異用SPSS

79、軟件(13.0)中的Dennett 檢驗法進行分析，蛻皮周期中各個時期的MIH的表達量在(P<0.05)存在顯著性差異的。結(jié)果表明</p><p>　　關(guān)鍵字：三疣梭子蟹；蛻皮；MIH；實時熒光定量PCR</p><p>　　Abstract：The method for the determination of the expression levels of molt-inhib

80、iting hormone mRNA in crustaceans (Portunus trituberculatus,) has been developed using relative quantification of quantitative real-time PCR（ qRT-PCR ）and we will use 2 - △△Ct method to analyze the expression of the mRNA

81、 of MIH. The experimental results indicated that the expression levels of MIH changed clear tendency with the molt cycle of Portunus trituberculatus progressed, MIH transcripts increased in post-molt </p><p>

82、;　　Keywords: Portunus trituberculatus; molt; MIH; qRt-PCR</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　三疣梭子蟹隸屬于軟甲綱，是中國沿海重要的大型海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類，近年來三疣梭子蟹人工育苗與養(yǎng)成的研究及實踐得到了較快的發(fā)展，但是仍舊面臨著存活率低（平均養(yǎng)殖成活率5%），病害頻發(fā)，養(yǎng)殖產(chǎn)量低，產(chǎn)品品

83、質(zhì)不高等問題。其中當年性早熟現(xiàn)象的危害尤其嚴重，以這種蟹種養(yǎng)殖商品蟹，死亡率高達60%-90%，從而導致養(yǎng)殖規(guī)格下降，效率低下[1]等問題。因此研究甲殼動物蛻皮周期的機制就顯得尤為重要，直接影響著養(yǎng)殖區(qū)域的產(chǎn)量。</p><p>　　在甲殼動物個體發(fā)育過程中，存在蛻皮現(xiàn)象，即蛻去舊的外骨骼并長出新的外骨骼的過程。蛻皮是甲殼動物生長和發(fā)育的標志特征，它貫穿甲殼動物個體發(fā)育的始終，它受神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)[2

84、]。根據(jù)游泳足趾節(jié)末端新舊表皮基線間距與舊表皮厚度的比值（R值）結(jié)合甲殼硬度、解剖后新殼的生長狀況、蛻皮縫的開裂狀況等形態(tài)學特征對三疣梭子蟹蛻皮周期進行了劃分，將蛻皮前期細分為D0、D1、D2、D3和D4五個亞期。</p><p>　　R= 趾節(jié)新舊表皮基線間距（D）/ 舊表皮厚度（C）</p><p>　　從表1中可以看出，蛻皮可以分為蛻殼前(Proeedysis stage，即D期，D

85、0-D4) 、蛻殼期(Molt stage，即E期)、軟殼期(Soft-shelled stage，即A期)、薄殼期(Papershell stage，即B期) 、硬殼期(Hard stage，即C期，C1 - C4) 5 個時相[3]。</p><p>　　表1 三疣梭子蟹蛻皮周期分期特征描述</p><p>　　Tab.1 Description of molt stages of

86、Portunus trituberculatus</p><p>　　甲殼動物的蛻皮過程是由眾多激素拮抗控制的，這一點已經(jīng)被大量的研究所證明，而這些激素大部分屬于一種被稱作為CHH（甲殼動物增血糖激素）家族的蛋白家族。研究表明在甲殼動物的眼柄中分泌著各種各樣的神經(jīng)內(nèi)激素[1]，他們中的大部分是在X-器官中合成的并且運送到鼻竇腺，在那里他們釋放到血淋巴之中。其中的神經(jīng)內(nèi)激素，包括甲殼動物增血糖激素（CHH），蛻皮抑

87、制激素（MIH），卵黃生成抑制激素（VIH）和顎器官抑制激素（MOIH），他們彼此都是十分相似的，因而組成了一個被稱為CHH家族的蛋白質(zhì)家族[4-5]。CHH家族中蛋白有著大致相同的蛋白質(zhì)序列，形成了3個穩(wěn)定的二硫鍵保守的6個半胱氨酸殘基，擁有著大概72-78個氨基酸殘基的相似數(shù)量，并且他們分子的重量都處在7000-9500 Da之間。因此，有科學家認為他們是從同一個祖先基因進化而來 [6]。 目前國內(nèi)外對于這類激素的研究主要在基因的

88、獲得以及表達方面，很少能夠把基因的表達與蛻皮的周期變化聯(lián)系起來，目前已經(jīng)得到了美洲黃道蟹 （Cancer magister）、可口美青蟹（Callinectes sapidus）、三葉真蟹（Carcinus mae</p><p>　　其中，對于以三疣梭子蟹為代表的甲殼動物中，蛻皮的過程中由MIH基因編碼的蛻皮抑制激素起著十分重要的作用。但是，目前很少有研究 MIH 基因與蛻皮周期變化之間的關(guān)系，在紅陸蟹（Gec

89、arcinus lateralis）的研究中表明，經(jīng)原核表達的MIH蛋白能對蛻皮過程產(chǎn)生抑制作用，從而對其蛻皮調(diào)控產(chǎn)生影響[9]。有研究者以Northern Bolt的方法對可口美青蟹蛻皮周期中MIH mRNA水平變化進行了測定分析，發(fā)現(xiàn)在蛻皮前期MIH的mRNA水平逐漸降低，蛻皮以后MIH的水平突然升高，在蛻皮期間持續(xù)升高，這在mRNA水平證實了MIH的生理功能[10]。MIH的靶器官是Y-器官，新產(chǎn)生的MIH通過抑制已形成的Y-器官

90、的合成和分泌蛻皮激素，起到抑制蛻皮的作用[11]。MIH通過和受體結(jié)合，激活了位于細胞膜上的腺甘酸環(huán)化酶而提高細胞內(nèi)cAMP水平，或是激活了位于細胞膜上的鳥甘酸環(huán)化酶而升高細胞內(nèi)cGMP水平，cAMP(或是cGMP)進而激活蛻皮激素生成途徑上的一種起重要負調(diào)控作用的激酶，進而抑制Y-器官蛻皮酮的合成，使甲殼動物體內(nèi)蛻皮激素保持在較低水平[12]。</p><p>　　MIH基因有6個半胱氨酸殘基在嚴格的保守區(qū)域存

91、在（圖1），有這6個半胱氨酸（Cys7–Cys44， Cys24–Cys40和 Cys27–Cys53）組成的二硫鍵對于維持其分子結(jié)構(gòu)起著十分重要的作用[13]。其他的存在于MIH及MIH類似片段的一些保守的殘基基本上分布在12，13，19，20，48，56，59，61，62，69，72，73和76位處。對于MIH基因而言，其N末端比C末端顯得更加保守，C末端一般被修飾或自由存在，而N末端經(jīng)常是游離的。一般情況下，對于MIH基因的檢測，

92、我們通常采用cDNA序列分析的方法，而已知的一些CHHⅠ家族的序列也能夠給予我們一些關(guān)于MIH基因序列的借鑒，但是最近的研究證明關(guān)于MIH分子的一些特征在CHHⅡ家族的分子中也有所體現(xiàn)。通過對于MIH基因的cDNA序列進行分析研究表明，發(fā)現(xiàn)cDNA包含210 bp的5 ’端非編碼區(qū)、342 bp的編碼區(qū)和1020 bp的3’ 端非編碼區(qū)。</p><p>　　圖1 多種MIH基因的生物信息學比對</p&g

93、t;<p>　　Fig 1 Bioinformatics comparison of various MIH genes</p><p>　　注：6個半胱氨酸殘基已經(jīng)用*標出，通過對Chf-MIH，Mee-MIHA， Mee-MIHB， Pem-MIH1， Pem-MIH2， Pem-SGP-C1， Pem-SGP-C2， Live-MIH1,和 Liv-MIH2的分析，內(nèi)含子的部分已經(jīng)用↓標出。

94、</p><p>　　3’端非編碼區(qū)包含一個保守的加尾信號（AATAAA），距離下游的Poly (A)12 bp。編碼區(qū)序列編碼113個氨基酸，包括35個氨基酸組成的信號肽和78個氨基酸組成的成熟肽[8]。MIH基因的序列，目前在國內(nèi)外已經(jīng)被研究的比較清楚，朱冬發(fā)等通過cDNA的克隆與序列分析等方法對其進行了比較系統(tǒng)的研究[8]。雖然如此，但是很少有人去研究MIH在蛻皮周期中各個分期時的分泌情況，因此本次試驗擬以

95、此為研究目標，希望能夠為以后的研究者提供借鑒，并對于甲殼動物在蛻皮周期中可能出現(xiàn)的一些癥狀進行判斷。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 材料</b></p><p>　　從海里捕撈新鮮的三疣梭子蟹，暫養(yǎng)于寧海得水育苗場。根據(jù)Drach 和Tchernigovtzeff（1

96、967）劃分把蛻皮周期標準：為蛻殼前期（Proeedysis stage，即D期，D0 - D4） 、蛻殼期（Molt stage，即E期）、軟殼期（Soft-shelled stage，即A期）、薄殼期（Papershell stage，即B期） 、硬殼期（Hard stage，即C期，C1 - C4）5 個時相，選取生長旺盛體重在40-80 g之間，頭胸甲寬為8 - 12 cm之間的三疣梭子蟹，采集蛻皮周期中各個時期的眼柄 X 器-

97、竇腺復合體，迅速保存于液氮中。</p><p><b>　　1.2 主要試劑</b></p><p>　　DEPC（RNase Free），Trizol，購自Sangon公司(加拿大) ；引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司（Invitrogen）完成；DNase I（RNase Free），PrimeScript RT reagent Kit，SYBR Premix

98、Ex Taq II，試劑盒均購自Takara公司（日本）。</p><p><b>　　1.3 方法</b></p><p>　　1.3.1 總RNA提取 </p><p>　　按 Trizol 試劑說明書提取相同時期 8 個 X 器-竇腺復合體 Total RNA，Total RNA經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，紫外分光光度計進行純度

99、分析。提取 Total RNA 后，再使用 DNase I 分解混入的基因組DNA，最后進行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等純化 Total RNA。</p><p>　　1.3.2 第一鏈cDNA合成 </p><p>　　每個Total RNA樣品取1.0μg，5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL，O

100、ligo（dT） Primer（50μmol/L）0.5μL，Random 6 mers（100μmol/L）0.5μL，RNase Free dH2O ，補足10 μL。具體操作參照PrimeScript RT reagent Kit說明書。</p><p>　　表 2 內(nèi)參基因與目的基因的引物序列</p><p>　　Table 2 Primer sequences for inter

101、nal control genes and targeted genes</p><p>　　注:A:產(chǎn)物大小(bp) Note: A: Product size (bp)</p><p>　　1.3.4 熒光定量PCR </p><p>　　熒光定量PCR在Mastercycler ep realplex real-time PCR (Eppendorf)上完

102、成，25 μL PCR的反應體系包括SYBR Premix Ex Taq II(2×)緩沖液12.5 μL，正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL（參見表2）。cDNA模板1 μL，dH2O 10.5 μL。程序采用三步法：為95 ℃ 30 s （1個循環(huán)），隨后進行40個循環(huán)，每一循環(huán)包括，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s。PCR結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析，以確保特異性擴增，條件是

103、95 ℃ 30 s，55 ℃ s，95 ℃ 15 s（1個循環(huán)）從55 ℃上升到95 ℃的過程耗時20min。</p><p>　　1.3.5 相對定量 </p><p>　　相對定量采用 2- △△Ct 方法，△△Ct =（Ct 目的基因 –Ct 管家基因）實驗組-（Ct 目的基因 –Ct 管家基因）對照組 ，計算實驗組目的基因的相對表達量。本實驗研究三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH表達變化