玉米光周期敏感基因ZmELF4的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)具有豐富的遺傳變異性,對(duì)其改良和利用是拓寬我國(guó)種質(zhì)資源的有效途徑。然而,影響其在溫帶地區(qū)利用的最主要限制因素就是光周期敏感性。因此,分離、克隆玉米光周期敏感相關(guān)基因并探知其功能,從分子水平揭示玉米光周期敏感現(xiàn)象、鈍化光周期敏感性,對(duì)熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)的有效利用具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究以熱帶玉米自交系CML288和溫帶玉米自交系黃早4為材料,利用同源克隆的方法克隆了與擬南芥ELF4、水稻OsELF4基因同源的

2、玉米ZmELF4基因；利用熒光定量PCR技術(shù),研究了不同材料相同光照、同一材料不同光照、不同組織、不同的發(fā)育階段以及其在非光周期條件下ZmELF4基因的表達(dá)規(guī)律,分析了ZmELF4基因與ZmCOL和ZmCCA1的關(guān)系；構(gòu)建了ZmELF4基因的融合表達(dá)載體及過(guò)量表達(dá)載體,并分別通過(guò)洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序侵染法進(jìn)行了過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用基因同源克隆技術(shù),首次

3、克隆了玉米的ZmELF4基因,GenBank登錄號(hào)為HQ009862。該基因序列中不存在內(nèi)含子,但是在5’非編碼區(qū)DNA序列中有一段約169bp的插入序列,而cDNA序列中沒(méi)有該段序列。獲得的cDNA序列全長(zhǎng)約680bp,含有432bp的開放性閱讀框,推測(cè)其編碼一條含有144個(gè)氨基酸的肽鏈。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),ZmELF4與水稻OsELF4位于同一進(jìn)化分枝,其親緣關(guān)系最近。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其含有保守的未知功能的DUF1313結(jié)構(gòu)域,推測(cè)

4、其是ELF4,/OsELF4的同源基因。
　　 2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了ZmELF4基因在CML288和黃早4中,在長(zhǎng)短日照兩種處理?xiàng)l件下的晝夜節(jié)律表達(dá)規(guī)律及其在不同組織、不同的發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律,分析了ZmELF4基因與擬南芥CCA1和CO在玉米中的同源基因ZmCCA1、ZmCOL的表達(dá)關(guān)系。結(jié)果表明,無(wú)論是CML288還是黃早4,長(zhǎng)短日照條件下,在葉片與莖尖中ZmELF4基因的表達(dá)都呈現(xiàn)出節(jié)律性,當(dāng)把植株挪移到連續(xù)光

5、照條件下后這個(gè)節(jié)律仍然不變,只是表達(dá)的振幅逐漸降低而已,并且兩種材料在相應(yīng)的長(zhǎng)短日照條件下表達(dá)高峰時(shí)期一致,只是整體表達(dá)量不同；在玉米的不同發(fā)育階段、不同組織ZmELF4也都表達(dá),但是兩種材料中的表達(dá)又明顯存在差異；此外,將ZmELF4的表達(dá)規(guī)律與ZmCCA1和ZmCOL的表達(dá)規(guī)律相比較發(fā)現(xiàn),它們之間存在密切的關(guān)系,并且ZmELF4與ZmCOL的表達(dá)高峰都處在光周期誘導(dǎo)開花的敏感時(shí)期內(nèi),推測(cè)ZmELF4可能與兩者相互作用,通過(guò)某種途徑共

6、同調(diào)控玉米光周期誘導(dǎo)開花的過(guò)程。
　　 3.利用基因重組技術(shù),成功構(gòu)建了帶有GFP標(biāo)記的融合表達(dá)載體pGIT-ZmELF4-GFP和能夠高效表達(dá)的過(guò)量表達(dá)載體pBI—ZmELF4,通過(guò)洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)對(duì)ZmELF4進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究,結(jié)果將其定位于細(xì)胞核；通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序侵染法將過(guò)量表達(dá)載體pBI—ZmELF4導(dǎo)入擬南芥進(jìn)行間接功能驗(yàn)證,獲得了7株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗,且轉(zhuǎn)化苗的開花期平均比野生型擬南芥推遲了25天左右,葉片數(shù)也比