人lrp-cDNA全長編碼區(qū)的克隆及其功能的初步研究.pdf

1、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌感染的主要致病因子，與某些炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。一般認(rèn)為，脂多糖(LPS)經(jīng)過脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)、脂多糖受體CD14及Toll樣受體將感染信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，然后由胞內(nèi)各相關(guān)信號傳導(dǎo)路徑介導(dǎo)引發(fā)機(jī)體的一系列反應(yīng)。 LPS信號傳導(dǎo)途徑非常復(fù)雜，盡管近10年來對LPS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的認(rèn)識有了很大的發(fā)展，但仍有許多關(guān)鍵的問題還不明白。很多過程仍是根據(jù)目前的研

2、究結(jié)果所做的推測。因此探索新的內(nèi)毒素應(yīng)答分子，并研究新發(fā)現(xiàn)的LPS相關(guān)分子的功能，將會幫助我們更加深入地了解LPS的作用機(jī)制。 lrp(lipopolysaccharideresponsedgene)是LPS應(yīng)答基因。系本課題組柴玉波博士采用基于PCR的改良消減雜交技術(shù)，構(gòu)建LPS刺激后人牙髓細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫，從中篩選出的新基因，GenBank錄入號為AF143740等。但當(dāng)時得到的只是編碼C-端186個氨基酸部分的cDN

3、A序列.隨后全長cDNA也相繼被克隆并錄入GenBank(錄入號NM018360等).生物信息學(xué)分析表明，全長人lrp基因的開放讀框?yàn)?584bp，編碼528個氨基酸，編碼序列中包含2個相互重疊的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和1個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)。 在未獲得全長人lrp-cDNA序列的情況下，本組杜可軍博士對基因編碼C-端186個氨基酸的部分進(jìn)行了組織分布情況、RNA干涉后對細(xì)胞影響等相關(guān)研究。但是由于一直沒有克隆出全長lrp-cDNA

4、編碼區(qū)序列，對其功能研究始終存在局限性。 為此，本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行了全長lrp-cDNA編碼區(qū)的克隆工作。采取RT-PCR的方法，從反轉(zhuǎn)錄獲得的人胚腎細(xì)胞(HEK293)cDNA文庫中擴(kuò)增全長lrp-cDNA編碼區(qū)序列。將其克隆入原核表達(dá)載體pcTAT，構(gòu)建可表達(dá)融合蛋白6His-TAT-Lrp的重組質(zhì)粒pcTAT-lrp，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。測序結(jié)果表明RT-PCR獲得了編碼全長Lrp-cDNA

5、的序列，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，誘導(dǎo)后表達(dá)了分子量69kD的6His-TAT-Lrp融合蛋白。然后用所表達(dá)蛋白免疫新西蘭大白兔制備兔抗人Lrp抗血清，并吸附去除非特異性反應(yīng)成分。Western印跡結(jié)果表明，吸附后的抗體可以與Lrp蛋白特異結(jié)合，并有較高免疫印跡滴度。 在獲得編碼全長Lrp-cDNA的序列和兔抗人Lrp多克隆抗體的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)接著進(jìn)行了Lrp在細(xì)胞中的定位、LPS對細(xì)胞中l(wèi)rp表達(dá)的影響以及Lrp對細(xì)胞周

6、期影響三個方面的實(shí)驗(yàn)分析。 1.Lrp在細(xì)胞中的定位為了確定Lrp在細(xì)胞中的定位，構(gòu)建了Lrp真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-lrp，將其瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，綠色熒光蛋白免疫組化染色后用激光共聚焦掃描熒光顯微鏡觀察Lrp在細(xì)胞中的分布情況。檢測結(jié)果表明Lrp在胞漿和核膜周圍均有分布，在核膜部位的分布尤為突出。接著用PCR法擴(kuò)增了lrp-cDNA編碼區(qū)的定點(diǎn)及截短突變序列，并連入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，瞬時

7、轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，綠色熒光蛋白免疫組化染色后用激光共聚焦掃描熒光顯微鏡觀察Lrp截短和定點(diǎn)突變后在細(xì)胞中定位的變化。結(jié)果顯示，截短蛋白Lrp△N仍然保留了一定的正常Lrp蛋白定位趨向，而點(diǎn)突變蛋白Lrpm只能看出主要分布于胞漿，已無向核膜周圍集中的表現(xiàn)。提示Lrp蛋白的定位信號區(qū)域可能位于C-端。 2.LPS對Lrp在細(xì)胞中表達(dá)的影響lrp是從LPS刺激后人牙髓細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫中篩選出的基因，為了確定LPS對細(xì)胞表達(dá)L

8、rp的水平到底有何影響，實(shí)驗(yàn)用加入了一定濃度LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)HEK293和U937細(xì)胞，建立脂多糖刺激的細(xì)胞生長模型，然后以未刺激的正常生長細(xì)胞為對照，進(jìn)行WesternBlot和DAB免疫組化染色分析。免疫印跡和免疫組化的分析結(jié)果都一致表明，經(jīng)過LPS刺激后，HEK293和U937細(xì)胞中Lrp的表達(dá)水平均明顯上升。說明Lrp可能與LPS介導(dǎo)的反應(yīng)有關(guān)。 3.Lrp對細(xì)胞周期影響生物信息學(xué)分析表明，人lrp基因編碼序列中

9、包含2個相互重疊的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，而亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)是DNA結(jié)合蛋白的特征型結(jié)構(gòu)；Lrp在細(xì)胞中的定位分析也表明，Lrp呈向核膜周圍集中分布的特征。說明Lrp的功能很可能與胞核相關(guān)，那么會不會影響細(xì)胞周期呢?為了分析Lrp對細(xì)胞周期影響，實(shí)驗(yàn)將lrp-cDNA序列連入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP，構(gòu)建可同時表達(dá)Lrp和綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-lrp，pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-lrp均瞬時轉(zhuǎn)

10、染HEK293細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀分別對LPS刺激與未刺激的轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞和LPS刺激與未刺激的轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-lrp的細(xì)胞帶綠色熒光的的群體作細(xì)胞周期檢測。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-lrp與轉(zhuǎn)染空載體的HEK293細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-lrp的細(xì)胞LPS刺激與未刺激比較，以及轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞LPS刺激與未刺激比較，結(jié)果顯示細(xì)胞周期中各階段的細(xì)胞數(shù)量比例并無明顯的變化。說明高表達(dá)Lrp對細(xì)胞周期并無顯著的影