人T-bet基因克隆及其功能的初步研究.pdf

1、人類轉(zhuǎn)錄因子T-bet(T-box expressed in T cells，T-bet)基因，作為Th1細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在Th1細(xì)胞分化中誘導(dǎo)IFN-γ，分泌，上調(diào)IL-12Rβ2的表達(dá)，同時(shí)抑制IL-4的表達(dá)。此基因的開(kāi)放閱讀框架包含1607bp，可編碼530個(gè)氨基酸殘基，其中有一個(gè)由189個(gè)氨基酸組成的能與T盒DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，主要在肺、脾臟及胸腺表達(dá)，其分布說(shuō)明T-bet的表達(dá)具有限制性。 目的 克隆并鑒

2、定人T-bet基因；構(gòu)建原核表達(dá)載體并在體外表達(dá)T-bet，蛋白，純化蛋白作為抗原免疫小鼠，制備并初步鑒定單克隆抗體；構(gòu)建攜帶穿膜序列(Tat)和目的基因(T-bet)的表達(dá)載體，通過(guò)大腸埃希菌表達(dá)TAT-T-bet蛋白，將此重組蛋白轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，初步觀察T-bet在調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡中的作用。 方法 (1)從人外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR擴(kuò)增獲得人T-bet基因；將T-bet基因

3、克隆至pGEM-T載體，進(jìn)行單、雙酶切鑒定及序列分析。 (2)將T-bet基因克隆到pQE30原核表達(dá)載體，在大腸桿菌M15中表達(dá)，獲得帶有His標(biāo)簽的62KD左右的T-bet融合蛋白；利用Bio-Rad公司的IMAC柱純化T-bet蛋白；以T-bet蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)并篩選得到分泌抗T-bet單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。 (3)T-bet基因克隆

4、到pIRES<,2>-eGFP真核表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒pT-bet通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入人單核巨噬細(xì)胞株THP-1，并以空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)THP-1細(xì)胞作為陰性對(duì)照；用G418篩選電轉(zhuǎn)陽(yáng)性細(xì)胞，得到單個(gè)克隆陽(yáng)性細(xì)胞株。 (4)將穿膜序列TAT重組到pQE30載體上，構(gòu)建具有穿膜功能的原核表達(dá)載體；再將T-bet基因重組到pQE30-TAT載體上，在大腸埃希菌M15中表達(dá)具有穿膜功能的T-bet蛋白；將純化的穿膜蛋白加入THP-1細(xì)胞培養(yǎng)體系，

5、觀察穿膜現(xiàn)象及效率；將蛋白轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞與外周血CD4<'+>T細(xì)胞共培養(yǎng)，初步觀察TAT-T-bet對(duì)THP-1細(xì)胞的作用，探討轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞對(duì)CD4<'+>T細(xì)胞分化的影響。 結(jié)果 (1)成功克隆了包括1607bp編碼區(qū)的人T-bet基因全長(zhǎng)，并在大腸埃希菌有效表達(dá)，獲得了純化的T-bet蛋白。 (2)成功制備了人T-bet單克隆抗體，經(jīng)三個(gè)月克隆和篩選，獲得三株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)EL

6、ISA和Western-blot鑒定具有良好的反應(yīng)性及特異性。 (3)構(gòu)建具有穿膜功能的pQE30原核表達(dá)載體，獲得T-bet穿膜蛋白，并以濃度和時(shí)間依賴的方式轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞與CD4<'+>T細(xì)胞共培養(yǎng)，能誘導(dǎo)CD4<'+>T細(xì)胞分泌IFN-γ，促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化。 結(jié)論 獲得了人T-bet克隆并在大腸埃希菌中有效表達(dá)。制備和純化了人T-bet蛋白，并以此為抗原，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了分