人新分泌蛋白基因的篩選、克隆與功能初步研究.pdf

1、分泌蛋白是一類功能非常重要的蛋白,參與了信號(hào)途徑、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、免疫防御等多種過程。分泌蛋白能夠適應(yīng)不同的藥物運(yùn)輸機(jī)制,可用作治療藥物或治療靶點(diǎn)。尋找新分泌蛋白并確定其生物功能有重要意義。 本研究使用各種生物信息學(xué)手段,包括 Secretome P1.0 server,Signal P,SOSUI,PSORT,Proteome Analyst's subcellularlocalization server 和

2、 BLAST,從來自人公共蛋白數(shù)據(jù)庫的共35446條蛋白序列中篩選新的分泌蛋白基因。其中NSP070,NSP078,NSP092和NSP093預(yù)測為經(jīng)典分泌蛋白,而NSP094,NSP095和NSP096預(yù)測為非經(jīng)典分泌蛋白。本論文著重對(duì)3個(gè)新的候選分泌蛋白基因進(jìn)行了初步研究,它們分別是NSP070,NSP092,及NSP096基因。 NSP070蛋白共有116個(gè)氨基酸,分子量為13302Da,定位于人12號(hào)染色體短臂12區(qū)

3、1帶(12p12.1)。運(yùn)用生物信息學(xué)分析得到,1至27個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,第58、64、73、95氨基酸為預(yù)測的絲氨酸磷酸化位點(diǎn),106為蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),第23位為潛在的N-糖基化位點(diǎn)。 通過轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞及Western Blot技術(shù)驗(yàn)證了NSP070是一個(gè)分泌蛋白。亞細(xì)胞定位分析表明NSP070蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中,且不與高爾基體共定位,提示NSP070是一個(gè)經(jīng)典分泌蛋白。再對(duì)NSP070進(jìn)行布雷菲爾德菌素A(Bref

4、eldin A,簡稱BFA,一種對(duì)依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體的蛋白分泌途徑的抑制劑)干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NSP070分泌被完全抑制,從而證明NSP070是一個(gè)經(jīng)典分泌蛋白.對(duì)NSP070 mRNA水平上的組織分布考察發(fā)現(xiàn)它在胎盤組織中有顯著表達(dá),在肺、肝、心、胸腺中也有低水平的表達(dá),同時(shí)免疫組化也揭示NSP070蛋白定位在胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層中,提示它可能會(huì)在人胎盤和胚胎發(fā)育階段起重要作用。另外,為了進(jìn)一步證實(shí)是否有像STRING數(shù)據(jù)庫所預(yù)測的NSP07

5、0蛋白與多個(gè)蛋白存在相互作用的問題,又構(gòu)建了NSP070原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,用異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),將制備并純化好的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白送到上海生物工程中心制備抗體?？贵w經(jīng)純化,通過免疫沉淀技術(shù),在人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中發(fā)現(xiàn)有很多互作蛋白。表達(dá)量高的兩個(gè)差異蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定分別為肌動(dòng)蛋白(actin)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase)。但是,當(dāng)用去除抗GST

6、的NSP070抗體再次做免疫沉淀時(shí)發(fā)現(xiàn)并沒有什么差異條帶,因此前階段發(fā)現(xiàn)的互作蛋白很可能是假陽性。用純化并去GST的NSP070抗體在另外人肝細(xì)胞L02中做免疫沉淀發(fā)現(xiàn),大約在70kDa.附近有一條差異條帶,但由于蛋白含量偏低質(zhì)譜鑒定未果。 NSP092蛋白共有393個(gè)氨基酸,分子量為44940Da,定位于人11號(hào)染色體短臂15區(qū)5帶(11p15.5)。運(yùn)用生物信息學(xué)分析得到,1至20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,81至384個(gè)氨基酸為

7、Glyco-18結(jié)構(gòu)域,第22、24、31、38、41、166、276、289、350位為預(yù)測的絲氨酸磷酸化位點(diǎn),第20、232、242、308、324、359位為預(yù)測的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),第84、93、157位為預(yù)測的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。另外,無N-糖基化修飾位點(diǎn)。通過轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞及Western Blot表明NSP092基因并不象預(yù)測的結(jié)果那樣編碼了一個(gè)經(jīng)典分泌蛋白,而是一個(gè)胞漿蛋白。對(duì)NSP092基因在mRNA水平上進(jìn)行組織分布

8、考察發(fā)現(xiàn),它在肺、腎、肝、心、胸腺中都有表達(dá),其中肝最高。在大多數(shù)肝癌細(xì)胞中的RT-PCR發(fā)現(xiàn):NSP092基因在肝癌細(xì)胞株HepG2高表達(dá),而在PCL,Foeus等其它肝癌細(xì)胞株未見表達(dá)。此外NSP092在人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo里也未見表達(dá)。遂將NSP092基因在LoVo細(xì)胞中建立穩(wěn)定株。細(xì)胞生長曲線揭示LoVo-NSP092穩(wěn)定細(xì)胞株有生長抑制的現(xiàn)象,克隆形成實(shí)驗(yàn)也表明與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1相比,克隆形成數(shù)明顯減少,而細(xì)胞

9、周期分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞株G1期發(fā)生阻滯(arrest)。這表明NSP092有可能是個(gè)潛在的抑癌基因。另外NSP092蛋白因?yàn)槠銰lycO_18結(jié)構(gòu)域而被預(yù)測具有水解幾丁質(zhì)作用的含有幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域1蛋白(CHIDl)。然而將其蛋白序列與現(xiàn)有已知的人的幾個(gè)幾丁質(zhì)酶蛋白序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn):它與其他序列的相似性很低,特別是NSP092不含有其它蛋白都具有的負(fù)責(zé)幾丁質(zhì)催化活性的一段蛋白序列FDGLDLDWEFPG,因此NSP092不具有水解幾丁質(zhì)的功能

10、。 NSP096蛋白共有132個(gè)氨基酸,分子量為13997Da,定位于人19號(hào)染色體短臂13區(qū)3帶(19p13.3).第72位為預(yù)測的絲氨酸磷酸化位點(diǎn),第10、79位為預(yù)測的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。運(yùn)用生物信息學(xué)分析得到:無信號(hào)肽,是一個(gè)非經(jīng)典分泌蛋白。那么,通過轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞及Western Blot技術(shù)表明NSP096是一個(gè)分泌蛋白,且分泌不受Brefeldin A抑制,從而證實(shí)NSP096的確是一個(gè)非經(jīng)典的分泌蛋白,即其

11、分泌途徑不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體途徑。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)也證實(shí)NSP096與高爾基體不共定位。糖苷酶PNGase F的去糖基化實(shí)驗(yàn)也表明NSP096無N-糖基化修飾。這些都輔助說明NSP096蛋白的非經(jīng)典分泌這一性質(zhì).對(duì)NSP096基因mRNA水平上組織分布的考察發(fā)現(xiàn),NSP096在肝臟中有特異性表達(dá),針對(duì)這種情況,決定考察NSP096基因在肝癌和癌旁中的表達(dá)情況。結(jié)果表明NSP096在肝癌中的表達(dá)是下調(diào)的。這也暗示了NSP096可能會(huì)在肝