新基因INMO2、TDRP的分子克隆及初步功能研究.pdf

1、第一部分胰島素作用靶組織糖尿病發(fā)病相關通路的研究
　　 目的:胰島素作用靶組織糖尿病發(fā)病相關通路的研究。方法:獲取糖尿病人和非糖尿病人的肝臟、肌肉和脂肪組織,抽提總RNA;基因芯片技術研究糖尿病人和非糖尿病人上述三個組織的差異基因表達譜;利用G0分類和KEGG分析,了解差異表達基因的分子功能和參與的代謝通路。結果:糖尿病人和非糖尿病人相比,肝臟、肌肉和脂肪三種組織共同上調表達的基因有66個,共同下調表達的基因有204個。G0分類

2、和KEGG分析得出的結果一致,氧化磷酸化有關的基因在糖尿病人肝臟、肌肉和脂肪三個組織中共同下調。結論:胰島素靶組織中氧化磷酸化通路相關基因的下調在胰島素抵抗和糖尿病發(fā)病中具有重要的作用。
　　 第二部分新型分泌蛋白INM02的克隆與初步功能研究
　　 目的:新基因-INM02的克隆及初步功能研究。方法:電子克隆出INM02的全長cDNA,并測序證實;Northern blotting建立INM02基因的組織表達譜:構建原

3、核表達載體pPROEXHT-INM02,并表達純化His-INM02融合蛋白;融合蛋白免疫新西蘭大白兔,制備INM02的多克隆抗體;建立INM02蛋白在人血清中檢測的ELISA方法;Northernblotting和免疫組織化學觀察INM02在胰腺組織中的細胞定位;分離并原代培養(yǎng)大鼠胰島細胞,不同濃度和作用時間段的葡萄糖刺激后,觀察INM02基因在MIN6細胞株和大鼠胰島細胞中的表達情況;挑選一批糖尿病和血糖正常人的血清,用ELISA研

4、究他們血清中INM02蛋白的含量。結果:人類INM02基因染色體定位于19q13.3-4,大小為16.5Kb,有12個外顯子,編碼序列包含762bp,編碼254個氨基酸殘基的蛋白。表達譜顯示INM02基因在睪丸、膀胱、肺臟表達豐富,在腎臟、腦、脾臟、肝臟、脂肪、小腸、心臟和骨骼肌等組織也有一定量的表達。建立了檢測INM02蛋白的ELISA方法,發(fā)現(xiàn)INM02是一個在血清中可以檢測得到的蛋白。Northern blotting和免疫組織化

5、學研究發(fā)現(xiàn)INM02表達于胰腺的內分泌細胞。MIN6細胞株和大鼠胰島細胞中INM02基因的表達受葡萄糖的調節(jié),高糖使INM02基因表達上調。糖尿病病人血清中INM02蛋白的含量低于正常人。結論:我們克隆到一個新的分泌蛋白-INM02,葡萄糖能夠調節(jié)INM02基因的表達,糖尿病病人血清中INM02蛋白的含量低于正常人,我們推測INM02的功能可能與糖尿病或胰島素分泌有關。
　　 第三部分新基因TDRP的克隆及在精子發(fā)生過程中的初步

6、功能研究
　　 目的:新的全長cDNA-TDRP的克隆及初步功能研究。方法:電子克隆出新基因TDRP的全長cDNA,并經(jīng)測序證實;Northern blotting建立TDRP基因的組織表達譜;Western blotting和激光共聚焦研究TDRP蛋白的亞細胞定位:原位雜交技術觀察TDRP基因表達在睪丸組織中的哪類細胞中;選取了18只不同發(fā)育階段的SD大鼠,分為6個年齡組,分別是出生后2天、7天、21天、2個月、6個月以及18

7、個月,每組3只,Northern blotting研究不同年齡段大鼠睪丸組織中TDRP基因的表達情況。結果:人類TDRP基因有兩個不同的轉錄本,大小分別是3.2Kb和2.4Kb。3.2Kb的轉錄本有3個外顯子,編碼序列包含549bp,編碼183個氨基酸殘基的蛋白。2.4Kb的轉錄本是由3.2Kb轉錄本的第3號外顯子剪切掉788個核苷酸而產生,其包含4個外顯子,完全讀碼框有594個核苷酸,編碼198個氨基酸的蛋白。3.2Kb和2.4Kb轉

8、錄本編碼的蛋白它們5'端的163個氨基酸是相同的。表達譜顯示TDRP基因主要表達于睪丸組織,并且表達量極其豐富,在腎臟和脂肪組織也有少量的表達。原位雜交顯示TDRP基因在睪丸組織中表達于生殖細胞,而在滋養(yǎng)細胞和間質細胞沒有表達。激光共聚焦實驗觀察到GFP-TDRP融合蛋白分布于細胞核;另外,Western blotting也證實TDRP融合蛋白主要表達于細胞核。Northern blotting結果顯示,TDRP基因在出生后2天和7天的