新基因INMO2、TDRP的分子克隆及初步功能研究.pdf

1、第一部分胰島素作用靶組織糖尿病發(fā)病相關(guān)通路的研究
　　 目的:胰島素作用靶組織糖尿病發(fā)病相關(guān)通路的研究。方法:獲取糖尿病人和非糖尿病人的肝臟、肌肉和脂肪組織,抽提總RNA;基因芯片技術(shù)研究糖尿病人和非糖尿病人上述三個(gè)組織的差異基因表達(dá)譜;利用G0分類和KEGG分析,了解差異表達(dá)基因的分子功能和參與的代謝通路。結(jié)果:糖尿病人和非糖尿病人相比,肝臟、肌肉和脂肪三種組織共同上調(diào)表達(dá)的基因有66個(gè),共同下調(diào)表達(dá)的基因有204個(gè)。G0分類

2、和KEGG分析得出的結(jié)果一致,氧化磷酸化有關(guān)的基因在糖尿病人肝臟、肌肉和脂肪三個(gè)組織中共同下調(diào)。結(jié)論:胰島素靶組織中氧化磷酸化通路相關(guān)基因的下調(diào)在胰島素抵抗和糖尿病發(fā)病中具有重要的作用。
　　 第二部分新型分泌蛋白INM02的克隆與初步功能研究
　　 目的:新基因-INM02的克隆及初步功能研究。方法:電子克隆出INM02的全長(zhǎng)cDNA,并測(cè)序證實(shí);Northern blotting建立INM02基因的組織表達(dá)譜:構(gòu)建原

3、核表達(dá)載體pPROEXHT-INM02,并表達(dá)純化His-INM02融合蛋白;融合蛋白免疫新西蘭大白兔,制備INM02的多克隆抗體;建立INM02蛋白在人血清中檢測(cè)的ELISA方法;Northernblotting和免疫組織化學(xué)觀察INM02在胰腺組織中的細(xì)胞定位;分離并原代培養(yǎng)大鼠胰島細(xì)胞,不同濃度和作用時(shí)間段的葡萄糖刺激后,觀察INM02基因在MIN6細(xì)胞株和大鼠胰島細(xì)胞中的表達(dá)情況;挑選一批糖尿病和血糖正常人的血清,用ELISA研

4、究他們血清中INM02蛋白的含量。結(jié)果:人類INM02基因染色體定位于19q13.3-4,大小為16.5Kb,有12個(gè)外顯子,編碼序列包含762bp,編碼254個(gè)氨基酸殘基的蛋白。表達(dá)譜顯示INM02基因在睪丸、膀胱、肺臟表達(dá)豐富,在腎臟、腦、脾臟、肝臟、脂肪、小腸、心臟和骨骼肌等組織也有一定量的表達(dá)。建立了檢測(cè)INM02蛋白的ELISA方法,發(fā)現(xiàn)INM02是一個(gè)在血清中可以檢測(cè)得到的蛋白。Northern blotting和免疫組織化

5、學(xué)研究發(fā)現(xiàn)INM02表達(dá)于胰腺的內(nèi)分泌細(xì)胞。MIN6細(xì)胞株和大鼠胰島細(xì)胞中INM02基因的表達(dá)受葡萄糖的調(diào)節(jié),高糖使INM02基因表達(dá)上調(diào)。糖尿病病人血清中INM02蛋白的含量低于正常人。結(jié)論:我們克隆到一個(gè)新的分泌蛋白-INM02,葡萄糖能夠調(diào)節(jié)INM02基因的表達(dá),糖尿病病人血清中INM02蛋白的含量低于正常人,我們推測(cè)INM02的功能可能與糖尿病或胰島素分泌有關(guān)。
　　 第三部分新基因TDRP的克隆及在精子發(fā)生過(guò)程中的初步

6、功能研究
　　 目的:新的全長(zhǎng)cDNA-TDRP的克隆及初步功能研究。方法:電子克隆出新基因TDRP的全長(zhǎng)cDNA,并經(jīng)測(cè)序證實(shí);Northern blotting建立TDRP基因的組織表達(dá)譜;Western blotting和激光共聚焦研究TDRP蛋白的亞細(xì)胞定位:原位雜交技術(shù)觀察TDRP基因表達(dá)在睪丸組織中的哪類細(xì)胞中;選取了18只不同發(fā)育階段的SD大鼠,分為6個(gè)年齡組,分別是出生后2天、7天、21天、2個(gè)月、6個(gè)月以及18

7、個(gè)月,每組3只,Northern blotting研究不同年齡段大鼠睪丸組織中TDRP基因的表達(dá)情況。結(jié)果:人類TDRP基因有兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本,大小分別是3.2Kb和2.4Kb。3.2Kb的轉(zhuǎn)錄本有3個(gè)外顯子,編碼序列包含549bp,編碼183個(gè)氨基酸殘基的蛋白。2.4Kb的轉(zhuǎn)錄本是由3.2Kb轉(zhuǎn)錄本的第3號(hào)外顯子剪切掉788個(gè)核苷酸而產(chǎn)生,其包含4個(gè)外顯子,完全讀碼框有594個(gè)核苷酸,編碼198個(gè)氨基酸的蛋白。3.2Kb和2.4Kb轉(zhuǎn)

8、錄本編碼的蛋白它們5'端的163個(gè)氨基酸是相同的。表達(dá)譜顯示TDRP基因主要表達(dá)于睪丸組織,并且表達(dá)量極其豐富,在腎臟和脂肪組織也有少量的表達(dá)。原位雜交顯示TDRP基因在睪丸組織中表達(dá)于生殖細(xì)胞,而在滋養(yǎng)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)觀察到GFP-TDRP融合蛋白分布于細(xì)胞核;另外,Western blotting也證實(shí)TDRP融合蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核。Northern blotting結(jié)果顯示,TDRP基因在出生后2天和7天的